猫杯状病毒的分子鉴定及系统进化分析

冯秋菊，马 燕，米高权，马 俊，白 翠

1.四川省凉山彝族自治州农业农村局农产品质量安全检测中心，四川西昌 615000；2.四川省凉山彝族自治州农业农村局植物检疫站，四川西昌 615000；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062

猫杯状病毒（FCV)为全长7.8 bp 单股正链RNA病毒，隶属于杯状病毒科，水疱疹病毒属，主要编码病毒的非结构蛋白（ORF1），VP1 主要衣壳蛋白（ORF2），VP2 次要衣壳蛋白（ORF3）[1]。ORF1 编码非结构蛋白，ORF2 编码衣壳蛋白，ORF3 编码一个较小区域的蛋白。猫杯状病毒是一种能引起猫高度接触性传染病的病原，猫杯状病毒感染是猫病毒性呼吸道传染病，该病是猫科动物较为常见的传染病之一。表现为口腔溃疡、肢体跛行、舌表面发生溃烂、流产、呼吸道感染、眼睑粘连、鼻软骨变形等症状。自然条件下，仅猫科动物易感，如猫、虎、狮和猎豹等，常发于6 ～84 日龄的幼猫。虽然该病的致死率较低，但是感染率却很高，严重的情况下会导致死亡[2,3]。该病在健康猫中，也可以发现这种病的病毒，该病毒在健康猫中带毒率也极高，带毒猫没有染病迹象，极难察觉。这表明在当前环境中，该病毒广泛存在，易感猫群难以保护。该病毒可通过空气传播，带毒猫的分泌物传播，以及排泄物传播，接触传播等多种方式进行传播，极具传染性。猫杯状病毒具有非常强的变异性，这种较强的变异性在抗原和致病性方面均有所体现。疫苗预防猫杯状病毒感染的效果并不理想，尤其是与高致病性猫杯状病毒的交叉免疫较少，因此导致临床免疫疫苗频频失败[3]。猫杯状病毒较强的变异性为该病的治疗与防范带来了极大的困难。因此，开展猫杯状病毒的流行性调查具有非常重要的意义。

本研究主要针对分离出的一株猫杯状病毒进行系统进化分析，分析该毒株的流行特征，为深入了解该病的流行特征奠定基础，同时为治疗以及预防该病等工作做好铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

四川省某宠物医院分离的一株猫杯状病毒。

1.1.2 主要试剂

Easypure® Viral RNA Kit，TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，2×EasyTap®PCR SurperMix，pEASY-T5® Zero Cloning Kit，北京全式金生物技术有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒均为Omega 公司。DL2000，TAKARA 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA 提取及cDNA 的合成

按照Easypure® Viral RNA Kit 的说明书提取病毒总RNA。

参 考TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 说明书进行反转录：Anchored Oligo（dT）18 Primer（0.5 µg/µL）1 µL，2×TS Reaction Mix 10 µL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 µL，gDNA Remover 1 µL，RNA 3 µL,RNase-free Water 补充体积至20 µL。轻轻混匀，42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 s 失活Trans-Script RT/RI 与gDNA Remover，获得的产物测定浓度后放入-20 ℃备用。

1.2.2 RT PCR 鉴定

使用FCV ORF2 引物进行PCR 检测。引物序列：F:5’-CAACCTGCGCTAACGTGCTTA-3’，R：5’-TTCCCCCAAAAACYCCAGATC-5’。PCR 反应体系为：2×Easy Tap PCR SuperMix 25 µL，上下游引物各1 µL，cDNA 模板4 µL，加无菌超纯水至50 µL。反应条件：预变性95 ℃ 5min，变性95 ℃ 45 s，退火59 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 min，40 个循环后总延伸72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。目的片段大小为681 bp。反应结束后，取5 µL PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 PCR 产物的回收

按照Omega 公司的凝胶回收试剂盒进行目的条带的回收纯化。首先通过凝胶成像系统从1%琼脂糖凝胶上切下目的DNA 片段，放入干净的1.5 mL 离心管中；向离心管中加入1 倍体积的Binding Buffer（XP2），50 ～60 ℃孵育7 min，每间隔2 ～3 min 就振荡一次，确保胶块充分溶解；将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入不超过700 µL的胶块溶解液，室温10 000 rpm，离心1 min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入300 µL Binding Buffer，室温13 000 rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附管中加入700 µL SPW，室温13 000 rpm，离心1 min，倒掉收集管中的废液；将空的吸附柱放到收集管中，室温13 000 rpm，离心2 min；将吸附柱转移至一个新的1.5 mL 离心管中，向吸附膜中间位置加入15 ～30 µL Elution Buffer，室温下静置2 min；室温13 000 rpm，离心1 min,收集DNA 溶液，放入-20 ℃备用。

1.2.4 目的基因克隆测序

按照pEASY-T5 Zero Cloning Vector Kit 说明进行回收产物的连接和转化。在PCR 管中依次加入PCR 回收纯化产物4 µL，pEASY-T5 Zero Cloning Vector 1 µL，轻轻混匀，25 ℃反应30 min。反应结束后，将PCR 管置于冰上。将连接产物转化至50 µL Trans1-T1 感受态细胞中。按照Omega E.Z.N.A.Plasmid DNA mini kit 的说明书提取菌液的质粒，以质粒为模板，进行PCR 鉴定，PCR 反应体系及反应程序同1.2.2。取5 µL PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出阳性克隆，将初步鉴定正确的阳性质粒送往上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果提交NCBI 进行序列比对。

1.2.5 FCV 分离株的系统发育分析

将测序结果与GenBank 的其他FCV 毒株进行DNA 序列比对。并利用MEG6.0 软件对分离得到的猫杯状病毒毒株与其他上传至GenBank 中的FCV 毒株进行系统发育分析。

2 结果

2.1 RT-PCR 结果

应用FCV 鉴定引物，经PCR 扩增，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示得到大小约为681 bp 条带，与预期结果相符。

2.2 CDV 14 株全基因组的系统发育分析

经序列对比可知该病毒为FCV，毒株系统发育分析结果显示：分离的猫杯状病毒毒株与目前国内流行的其他毒株相似性较低，疑似为新的变异毒株。

3 讨论

猫杯状病毒可以引起猫的慢性呼吸道疾病。该病毒可以通过飞沫等方式进行传播，其主要症状为口腔溃疡、鼻结膜炎、肺炎等，严重时可致使感染猫面部及四肢出现浮肿、高烧、出血性病变等急性症状，死亡率高达60%。现在部分家庭进行多猫养殖，部分猫进行野外活动，并且这一部分猫大多活泼好动，这使得病毒更容易在它们之间进行传播。部分猫表现为无症状感染，在它接近免疫力更为低下的其他猫时，会使得这些免疫力低下的猫群感染患病。由于该病毒具有较高的变异性，因此没有十分有效的针对性疫苗，即使注射疫苗的猫群也有可能感染该病毒。由于猫杯状病毒ORF2 编码的衣壳蛋白是刺激机体产生免疫应答的主要蛋白，该基因是研究猫杯状病毒基因工程疫苗的主要靶基因[4,5]。

本研究分析的猫杯状病毒毒株与其他毒株具有较低的同源性，但没有形成明显的独立分支，其遗传 相 关 性 与KT000003、KM016908 和KX371573 较近。上述结果表明分离得到的猫杯状病毒与国内流行的毒株有明显的差异，遗传进化较大，初步怀疑是新的变异株。最近有研究报道，国内有新的猫杯状病毒流行株出现，郭慧敏等于2018 年首次报道了VS-FCV 在我国流行，汤傲星等于2021 年首次发现华东地区猫杯状病毒不断发生变异[6]。另有研究报道同样表明，猫杯状病毒毒株相互之间的同源性不高，来源比较复杂。

变异毒株的不断出现，致使传统疫苗不能起到很好的免疫保护作用。目前预防猫杯状病毒感染使用最多的仍然是接种疫苗进行免疫。因此，开展猫杯状病毒的流行性调查及遗传进化分析，为猫杯状病毒疫苗的研究提供理论参考。