基于宏基因组学的反刍动物瘤胃微生物研究进展

余国春

四川省水产学校,四川 成都 611730

0 引言

反刍动物瘤胃是最强的微生态系统之一,其中含有细菌、原虫和真菌等逾3 000种微生物[1],与宿主的各项生理生化功能密切相关。但瘤胃中的绝大多数微生物极度厌氧,培养极其不易,传统研究弊端显著。宏基因组测序作为新兴组学技术,规避了传统培养研究的缺陷,且更能透彻地揭露微生物多样性、差异性、功能性及其与宿主间的相互关系,在瘤胃微生物群落的研究上具有广阔的前景。本文聚焦宏基因组学的研究方法,重点讨论瘤胃微生物功能的相关影响因素,以期为提高反刍动物生产水平提供思路。

1 宏基因组学研究方法

宏基因组在反刍动物瘤胃微生物中的研究主要包括以下核心环节。

1.1 样本采集

瘤胃口腔导管法或屠宰法采集瘤胃液,经过滤后立即存于液氮罐。

1.2 宏基因组DNA提取

根据试剂盒说明书分离纯化DNA,并用1.0%的琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop分光光度计或Qubit荧光定量仪进行测验评价。

1.3 宏基因组测序

运用PCR制作文库并进行Illumina高通量测序平台测序。

1.4 数据预处理

1)采用Trimmomatic软件对原始数据进行过滤和质控。

2)使用SOAPdenovo软件、MEGAHIT软件或IDBA-UD软件对优化数据进行拼接和组装。

3)利用prodigal软件对瘤胃宏基因组序列进行基因目录的构建。

1.5 生物信息学分析

应用BLAST将构建的基因序列予以分析。

1)与GenBank的NR数据库(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/taxonomy/) 进行比对,获得物种注释。

2)与COG数据库 (https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/COG/)、GO数据库 (http: //www.geneontology.org/) 和KEGG数据库 (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 进行比对,获得基因功能注释。

3)根据需要与CAZy数据库 (http://www.cazy.org/) 进行比对,获得碳水化合物活性酶注释。

2 宏基因组学揭露反刍动物瘤胃微生物影响因子

瘤胃微生物系统是一个人类知之甚少的微生态环境,作为浩瀚微生物的聚居地,微生物族群在此或共生或寄生或竞争或捕食,关系错综复杂且功能繁复,它们的功能是否正常发挥也决定了反刍动物的养殖成果和经济效益。宏基因组 (metagenome),也称元基因组,由Handelsman et al.[2]在1998年首次提出,其定义为特定环境中全部微生物基因组的总和。随着技术的不断探索和熟化,Kittelmann[3]于2013年创投了一种避免对非目标DNA测序,可同时高效分辨细菌、古菌、原虫、真菌、核糖体间隔区的方法。近年来,因其维度广、准确率高,宏基因组测序被广泛用于瘤胃微生物分类、功能注释及代谢通路等[4-5]。

2.1 遗传生理对瘤胃微生物的影响

2.1.1 种属对瘤胃微生物的影响

源于生存本能,生命繁衍进化,万物生而有异,不同种属反刍动物的瘤胃微生态又是否有所不同?运用宏基因组技术系统,Gao et al. 比较了盖亚尔牛和云南黄牛瘤胃微生物的差异,结果表明2个品种在细菌、古菌和真菌方面确实存在差异,盖亚尔牛的厚壁菌门与拟杆菌门的比例(1.06)高于云南黄牛(0.66),碳水化合物活性酶注释结果显示盖亚尔牛GH5、GH26、GH94、CBM11和CBM63的丰度高于云南黄牛。Wang et al.研究了盖亚尔牛、牦牛、西藏黄牛和云南黄牛的瘤胃真菌组成,鉴别出作为3个真菌门 (担子菌门、子囊菌门和新丽鞭毛菌门) 中丰度之首,厌氧真菌新丽鞭毛菌门的优势属的组成在4种牛中差异很大,未分类属在4个品种间也存在分布不均的现象,分别占90.63%、98.52%、97.79%和27.01%。

2.1.2 生境对瘤胃微生物的影响

麻雀虽小五脏俱全,细胞的差异性演化造就了各司其职的组织、器官、系统和功能全备的机体。瘤胃素有“发酵罐”之称,固相和液相2种生境相伴而生,合理推测生境的区别存在功用的分歧。Mullins et al.对8头泌乳荷斯坦奶牛进行宏基因组检测,全混合饲粮饲喂下,液相中主要以牛链球菌、栖瘤胃普氏菌和溶纤维丁酸弧菌为主,而固相中则存在更高比例的啮齿真杆菌、产琥珀酸丝状杆菌以及白色瘤胃球菌,证实即使同一个体中瘤胃液相和固相的微生物菌群也明显不同。

2.1.3 年龄对瘤胃微生物的影响

动物的生理年龄与其生长发育和性能密切相关,它又与瘤胃微生物有无联系呢? 就新生动物中微生物种群的定植及后续变化,Jami et al.[9]设置了1日龄～2岁龄的5个年龄组,对相同饲喂条件的16 头荷斯坦奶牛瘤胃细菌种群进行分析,研究结果表明:群落多样性和群内相似性随着年龄的增长而增加,成熟群落的多样性和同质性较强,而初级群落的多样性较弱。

2.1.4 生理对瘤胃微生物的影响

相较于正常生理状态,在病理状态下微生物的数量、类别和组成均会改变,进而导致机体的功能、代谢、形态、结构等出现异常。除此之外,不同生理状态 (如配种期、妊娠期和哺乳期) 的瘤胃生境或也不同,但相关对比分析较少。

2.2 饲养管理对瘤胃微生物的影响

2.2.1 饲料对瘤胃微生物的影响

饲料种类繁多、配制方法各异,为保证反刍动物的健康和高产,学者们探寻不同饲料对瘤胃微生物组的影响。Pitta et al.[10]对低蛋白高纤维(狗牙根草组)到高蛋白低纤维(冬小麦组)饲料转变的肉牛瘤胃内容物进行测序,阐明狗牙根草组和冬小麦组的液相存在的微生物分别为149 个属和118 个属,其中普氏菌属丰度均为最高,进一步论证了饲料配比的确在微生物水平上对动物机体产生影响。

2.2.2 添加物对瘤胃微生物的影响

饲料添加剂的养殖效益明显,但食品安全隐患也随之攀升。于萍 等[11]研究了饲喂纳豆枯草芽胞杆菌的犊牛,证实纳豆枯草芽胞杆菌有助于断奶犊牛瘤胃细菌区系的建立和纤维分解菌群的定植和生长,且主要菌落是拟杆菌门和壁厚菌门。安雅静 等[12]对瘤胃液样本进行组学分析,揭示了黄曲霉毒素B1能降低拟杆菌门及厚壁菌门的丰度,而对普雷沃氏菌发挥抑制作用。朱智[13]探索了山羊瘤胃液中的细菌菌属,得出灌注大蒜油会降低丁酸弧菌的比例,但也同时提高了菌种的遗传多样性。

2.2.3 养殖方式对瘤胃微生物的影响

依据市场导向、饲养环境、规模等因素,牛羊养殖方式应势选取,生产效益也不甚相同,但其与瘤胃微生物群的关联鲜有研究。为此,李娟 等[14]选取了10头健康青年雄性麦洼牦牛,对比研究了舍饲养殖和放牧养殖下瘤胃微生态的差异,显示舍饲提高了优势菌门(厚壁菌门和拟杆菌门)、功能蛋白(瘤胃微生物转录、辅酶转运和代谢等)和3大代谢通路(碳水化合物代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢)的相对丰度,并使得体重显著增加,印证了舍饲的养殖优势。

3 展望

瘤胃是一个极其庞大而复杂的生物资源库,瘤胃微生物与纤维饲料的消化[8]、营养物质的吸收[15]和瘤胃壁绒毛的发育[16]相关,其中蕴藏着不计其数的有待挖掘的基因。采用宏基因技术系统所得到的生物学信息,可深入挖掘反刍动物瘤胃微生态的奥秘,但碍于一些因素相关研究仍然相对滞后。

如今,得益于宏基因组学技术的联动,许多学者对瘤胃微生物功能展开了积极深入的探索,尝试并实际挖掘出一些与重要营养生理功能密切相关的瘤胃微生物功能基因。但宏基因组学的核心是与现存数据库进行比对,数据库的现有数据却落后于宏基因组学的发展态势;加之测序读长和成本的限制,制约了宏基因组学的推广和应用。随着数据库的升级和完善,分析平台的构建和完备,测序技术的优化和改进,以及测序成本的降低,宏基因组学势必成为探究瘤胃生态系统的重要工具。