四妙汤对类风湿关节炎大鼠维生素D 系统及中性粒细胞胞外诱捕网的影响研究

2023-11-14 07:32罗书曼朱星陈帅李文董右青何昌禄周艳陈云志
中国全科医学 2024年3期
关键词:滑膜批号血清

罗书曼,朱星,陈帅,李文,董右青,何昌禄,周艳,陈云志*

1.550025 贵州省贵阳市,贵州中医药大学

2.554300 贵州省铜仁市德江县民族中医院推拿科

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、系统性的自身免疫性疾病,主要病理特征为持续性滑膜炎和滑膜增生。目前全球RA 患病率约为1%[1]。RA 致死率不高,但有较高致残率,对患者身体功能及生活质量影响较大,有“不死癌症”之称。RA 患者发生心血管疾病等并发症的概率远高于普通人,增加了患者因心血管疾病死亡的风险,而糖皮质激素作为RA 常用治疗药物,在临床使用时增加了RA 合并心血管疾病患者的死亡率[2]。因此寻找低毒高效的RA 治疗药物是目前公共卫生系统的共同挑战。流行病学数据显示,维生素D(VD)缺乏与自身免疫性疾病有关,其中血清25-羟基维生素D3[25(OH)D3]水平与RA 发病率和疾病活动之间存在负相关[3]。动物实验研究表明,VD 可缓解RA 小鼠模型的关节炎症状,降低关节炎评分[4]。临床研究表明,使用VD 补充剂可降低RA 发展风险[5]。VD、维生素D 受体(VDR)及相关代谢酶共同组成维生素D 系统,维生素D 系统通过多种途径参与免疫调节,其中通过抑制树突状细胞、T 细胞、B 细胞的免疫反应导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等细胞因子产生减少,抑制RA 的发生、发展[6]。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞受到刺激形成的以DNA 为骨架的网状结构[7],其形成过程被称为中性粒细胞胞外诱捕网凋零(NETosis)。NETs 的过度表达在RA 病理过程中发挥重要作用,促进抗瓜氨酸化抗体(ACPA)的产生,加重RA 进程[8]。研究表明,VD 可通过降低NETs 标志物髓过氧化物酶(MPO)活性,抑制NETs 形成[9];活性形式的VD,即1,25-二羟基维生素D[1,25(OH)2D3]可降低NETosis 活性,抑制NETs 形成[10]。

中医将RA 归属“痹证”范畴[11]。“痹”者,“闭”也,血气凝滞不通也[12]。气血运行不畅在痹证的发病过程中起关键作用,调畅气机、活血通络开痹是治疗重点。四妙汤见于清·蒋示吉《医宗说约》,是由两个药对组成的药少力专的方剂,黄芪和当归组成当归补血汤,补气生血,金银花与甘草组为银花甘草汤,清热解毒,方中四药合伍,共奏益气合血、托里解毒功效[13]。研究表明当归补血汤对骨质疏松大鼠模型维生素D 系统有调节作用[14],当归补血汤含药血清对RA 滑膜炎症有抑制作用[15]。基于中医理论及前期研究成果,故推测,四妙汤通过调节维生素D 系统影响NETs 的形成有效改善RA。因此,本研究通过胶原诱导法建立滑膜型关节炎大鼠模型,深入探索四妙汤治疗RA 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验时间:2021 年11 月—2023 年1 月。

1.1.2 实验动物:SPF 级6~7 周龄SD 雌性大鼠70 只,体质量200~220 g,购自贵州中医药大学实验动物研究所,许可证号:SCXK(黔)2021-0003,所有大鼠在贵州中医药大学实验动物研究所饲养,室温22~25 ℃,相对湿度50%~60%,适应性饲养1 周后进行造模实验。本实验所有程序通过贵州中医药大学实验动物研究所动物伦理审查(编号:20210100)。

1.1.3 实验药物和试剂:黄芪(批号:20210503)、当归(批号:20210609)、金银花(批号:20210763)、甘草(批号:20210921)均购自北京同仁堂贵阳药店,上述所有药材经贵州中医药大学方药教研室蒋志滨副教授鉴定为合格中药饮片。甲氨蝶呤片(MTX)(上海上药信谊药厂有限公司,批号:036210906),维生素D 滴剂(青岛双鲸药业股份有限公司,批号:2104191),牛Ⅱ型胶原蛋白(上海源叶生物科技有限公司,批号:L22S11C125306),弗氏不完全佐剂(美国SIGMA 公司,批号:SLCH4885),冰乙酸(四川西陇科学有限公司,批号:2104131),大鼠IL-6、NETs、25(OH)D3ELISA 试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司,批号:ZC-36404、ZC-54723、ZC-35943),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)抗体(美国Affinity 公司,批号:AF7021、AF0010),1-α 羟化酶(CYP27B1)抗体(美国Rioss 公司,批号:Bs-14146R),MPO 抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:22225-1-AP),VDR 抗体、24-羟化酶(CYP24A1)抗体(美国ABclonal 公司,批号:A2194、A1805)。

1.1.4 主要仪器:Multiskan MK3 型酶标仪(美国Thermo 公司),DYY-6C 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司),L500-A 型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),光学显微镜(德国Leica 公司),Universal Hood Ⅱ型核酸蛋白凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 四妙汤的制备:四妙汤水煎剂由黄芪、金银花、当归、甘草按照10∶8∶2∶1 比例配伍组成,将4 味药材用纯净水浸泡60 min 后,武火煮沸,转文火煎煮30 min,取滤液,重复操作,合并两次滤液利用旋转蒸发仪浓缩生药浓度至0.63 g/mL 备用。

1.2.2 大鼠分组:采用随机数字表法将大鼠分为空白组(Control 组)、模型组(Model 组)、甲氨蝶呤组(MTX组)、维生素D组(VD组)、四妙汤低剂量组(SMT-L组)、四妙汤中剂量组(SMT-M 组)、四妙汤高剂量组(SMT-H组),每组10 只。

1.2.3 CIA 大鼠模型造模:大鼠参考文献[16]造模,用蒸馏水配制0.05 mol/L 乙酸溶液,将牛Ⅱ型胶原蛋白溶于乙酸溶液中制成浓度为2 g/L 溶液,4 ℃环境下摇床震荡过夜至完全溶解,隔天冰上操作与弗氏不完全佐剂1 ∶1 比例混合制成胶原乳液。分别在大鼠背部、尾根部、双侧后足垫四点皮下各注射胶原乳液0.1 mL 进行初次免疫,Control 组以相同方式注射等量0.9%氯化钠溶液,初次免疫7 d 后,在大鼠背部及尾根部两点皮下各注射0.1 mL 乳液加强免疫。以体质量下降,大鼠关节、脚踝及足部出现泛红伴随肿胀作为造模成功的标准。随机抽取2 只大鼠,采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠滑膜组织的病理学改变,若出现滑膜增生、炎性细胞浸润、纤维组织增生等系列变化,提示CIA 模型建立成功。

1.2.4 药物干预:于加强免疫7 d 后开始灌胃治疗,根据成人用量按照人与大鼠体表面积折算等效剂量[17],SMT-L、SMT-M、SMT-H 组分别给予四妙汤水煎液3.15 g·kg-1、6.30 g·kg-1、12.60 g·kg-1灌胃,VD 组给予VD 滴剂25 μg·kg-1,Control 组和Model 组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃,MTX 组给予MTX 1.5 mg·kg-1灌胃,2 次/周,其余各组均为1 次/d,药物干预28 d。

1.3 指标检测

1.3.1 大鼠一般状况及踝部肿胀程度:观察药物干预前后,大鼠体质量、摄食情况、四肢活动情况及皮毛色泽等一般状况。每组选取10 只大鼠,分别于药物干预第0、7、14、21、28 天用电子秤测量并记录大鼠体质量,用游标卡尺测量大鼠踝部直径,以评估踝部肿胀程度,当前测量直径减去初始测量直径视为肿胀程度。

1.3.2 关节炎指数(AI)评分:分别于药物干预第0、7、14、21、28 天,按照AI 评分标准进行评分并记录。0 分:关节无红肿胀症状;1 分:踝关节轻微肿胀;2 分:踝关节轻度红肿伴足趾有红斑;3 分:踝关节累及足趾中度红肿;4 分:踝关节及全足重度红肿,每只大鼠的四肢累计得分为AI 评分。

1.3.3 关节滑膜组织病理学检测:药物干预结束后,将大鼠踝关节取下置于4%多聚甲醛固定72 h,脱钙、流水冲洗24 h、标本脱水、包埋、切片。采用HE 染色进行切片,显微镜观测并采集图像分析大鼠关节组织病变情况。

1.3.4 免疫组化法检测滑膜组织MPO、TNF-α 表达情况:将制备好的滑膜组织切片进行脱蜡水化、磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗、抗原修复、血清封闭孵育,配置合适浓度的一抗(MPO 1∶40,TNF-α 1∶50)4 ℃孵育过夜,PBS 冲洗后滴加稀释后的相应二抗,37 ℃烘箱孵育30 min,PBS 冲洗后加入显色液,脱水封片。将切片在显微摄像系统下观察并采集图像,每张切片采集3 张,使用HALO 数字病理图像分析工具分析每张图像的MPO、TNF-α 阳性面积占比。

1.3.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清中IL-6、25(OH)D3、NETs 水平:药物干预结束后,大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,经腹主动脉取血,室温静置30 min,4 ℃离心10 min(3 000 r/min,离心半径14 cm),分离收集血清,置于-80℃冰箱备用,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-6、25(OH)D3水平,采用基于MPO-DNA 复合物的捕获酶联免疫吸附法测定NETs 水平,严格按照ELISA 试剂盒说明书进行操作,显色后在酶标仪450 nm波长条件下依序测量各孔内OD 值,并根据获得的标准曲线方程,计算样品浓度。

1.3.6 蛋白质印迹法(Western blotting)检测关节滑膜组织CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、弹性蛋白酶(NE)表达水平:分离出大鼠踝关节滑膜组织放入2 mL 研磨管中,按样本比例向管中加入RIPA 裂解液和钢珠,低温研磨仪研磨2 次,后设置离心机4 ℃以12 000 r/min离心5 min,分离出上清液置冰箱-20 ℃备用。依照BCA 试剂盒标准蛋白浓度和相应OD 值,计算样本蛋白浓度。配置电泳胶、上样、电泳、转膜,用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)室温下摇床震荡封闭2 h,TBST洗膜3 次,放入孵育盒,加入稀释过的一抗4 ℃孵育过夜,一抗稀释比例:CYP24A1(1∶1 000)、CYP27B1(1∶1 000)、MPO(1∶2 000)、VDR(1∶1 000)、NE(1∶1 000)。TBST 洗膜3 次,加入HRP 标记二抗(1∶600稀释),37 ℃摇床孵育2 h,TBST 充分洗膜。最后配置ECL 显影液,均匀滴加到聚偏二氟乙烯膜上,暗室曝光成像,扫描胶片,用BandScan 凝胶图像分析软件分析胶片灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料以(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况及肿胀度变化

正常组大鼠四肢活动正常,精神状态良好,摄食正常,皮毛有光泽;模型组大鼠自初次免疫7 d 后逐渐出现四肢活动异常,精神状态不佳,喜蜷卧角落,皮毛晦暗。干预第0 天7 组大鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05),第7、14、21、28 天7 组大鼠体质量比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中第7 天VD 组、SMT-L 组、SMT-H 组高于Model 组,第14 天Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-H 组高于Model 组,第21、28 天Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组高于Model 组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 7 组大鼠体质量比较结果(g)Table 1 Comparison of weight change result of rats in the seven groups

干预第0、7、14、21、28 天7 组大鼠肿胀程度比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中第0 天Model组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H组高于Control 组,第7 天Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组低于Model 组,第14天Model 组高于Control 组,SMT-M 组高于Model 组,第21 天Model 组高于Control 组、MTX 组,低于VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组,第28 天Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组低于Model 组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 7 组大鼠肿胀程度比较结果(mm)Table 2 Comparison of the swelling degree of rats in the seven groups

2.2 7 组大鼠AI 评分比较

药物干预第0、7、14、21、28 天,Control 组大鼠AI 评分均为0 分。干预第0、7 天各组大鼠AI 评分均高于Control 组(P<0.05);干预第14、21、28 天各组大鼠AI 评分比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中第14 天SMT-H 组低于Model 组,第21 天MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-H 组低于Model 组,第28 天MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组低于Model 组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 7 组大鼠AI 评分比较结果(分)Table 3 Comparison of AI scores of rats in the seven groups

2.3 7 组大鼠关节滑膜组织病理学检测结果

HE 染色组织细胞核呈蓝色,软骨呈深蓝色,细胞浆呈粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈鲜红色,胶原纤维呈淡粉色。Control 组大鼠滑膜组织结构完整,骨层清晰,衬里层滑膜细胞排列疏松,未见病理改变;Model 组大鼠滑膜组织衬里下层大量炎性细胞浸润、滑膜细胞异常增生、关节面被破坏出现不同程度的纤维组织增生;与Model 组比较,各给药组大鼠滑膜组织的病理状态均有改善,其中MTX组、SMT-H组改善较为明显,炎性细胞浸润减少,关节面相对完整,少量纤维增生,见图1。

图1 7 组大鼠关节滑膜组织病理学检测结果(HE 染色,×50)Figure 1 Results of joint synovial histopathology in 7 groups of rats

2.4 7 组大鼠滑膜组织MPO、TNF-α 表达水平比较

二氨基联苯胺法染色蛋白阳性表达为棕黄色,MPO阳性产物主要表达于细胞核、细胞质及细胞间质,TNF-α 阳性产物主要表达于细胞质及细胞间质。免疫组化法结果显示,7 组大鼠滑膜组织MPO、TNF-α表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中Model 组MPO、TNF-α 高于Control 组,MTX 组、VD组、SMT-H 组MPO、TNF-α 低于Model 组,SMT-M组TNF-α 低于Model 组,差异有统计学意义(P<0.05),见图2~3、表4。

图2 7 组大鼠滑膜组织MPO 表达情况(免疫组化法,×40)Figure 2 MPO expression in synovial tissue of 7 groups of rats

图3 7 组大鼠滑膜组织TNF-α 表达情况(免疫组化法,×40)Figure 3 Expression of TNF-α in synovial tissue of 7 groups of rats

表4 7 组大鼠滑膜组织MPO、TNF-α 表达水平比较(%)Table 4 Comparison of MPO and TNF-α expression levels in synovial tissue of 7 groups of rats

2.5 7 组大鼠血清IL-6、25(OH)D3、NETs 水平比较

7 组大鼠血清IL-6、25(OH)D3、NETs 水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中Model 组IL-6、NETs 高于Control 组,25(OH)D3低于Control 组;MTX 组、VD 组、SMT-H 组IL-6、NETs 低于Model 组,25(OH)D3高于Model 组;SMT-M 组NETs 低于Model 组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 7 组大鼠血清IL-6、25(OH)D3、NETs 水平比较Table 5 Comparison of serum levels of IL-6,25(OH)D3 and NETs in 7 groups

2.6 7 组大鼠关节滑膜组织CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相对表达量比较

7 组大鼠CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中Model 组CYP24A1 高于Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-M 组、SMT-H 组,CYP27B1、VDR 低于Control组、MTX 组、VD 组、SMT-M 组、SMT-H 组,MPO 高于Control 组、MTX 组、VD 组、SMT-L 组、SMT-M 组、SMT-H 组,NE 高于Control 组、VD 组、SMT-M 组、SMT-H 组,差异有统计学意义(P<0.05),见表6、图4。

图4 7 组大鼠关节滑膜组织CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE蛋白质印迹法检测结果Figure 4 CYP24A1,CYP27B1,MPO,VDR,NE detected by Western Blot in synovial tissue of 7 groups of rats

表6 7 组大鼠滑膜组织CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相对表达量比较Table 6 Comparative expression of CYP24A1,CYP27B1,MPO,VDR and NE in synovial tissue of 7 groups of rats

3 讨论

中医认为RA 的病因主要为素体虚弱、正气不足、脏腑虚衰[18]。《诸病源候论》指出“人体虚,腠理开”,导致风、寒、湿三种外邪入侵,证候复杂,病势反复缠绵;《素问·评热病论篇》云:“邪之所凑,其气必虚”[19]。四妙汤益气和血,补虚生血,组方切合RA 基本病机,方中黄芪、当归、金银花、甘草均属于临床治疗RA 的高频次用药[20]。现代药理研究发现,甘草查尔酮A 是存在于甘草的活性物质,具有抗氧化、抗炎等多种药理作用[21],甘草中含有的柚皮素可通过影响大鼠血清中TNF-α 等炎性因子的含量,改善关节炎大鼠的炎症细胞浸润[22]。黄芪、金银花、甘草中均含有的有效成分槲皮素和山奈酚能显著改善RA,槲皮素是天然黄酮类化合物,通过降低氧化应激反应、抑制细胞增殖和迁移、减少炎性因子、促进滑膜成纤维细胞因子(FLS)的凋亡进而抑制滑膜炎症,减少RA 的骨损害[23],山奈酚可显著抑制丝裂原活化蛋白激酶通路的激活,降低RA中FLS 的迁移和侵袭,能有效减轻CIA 小鼠关节炎的严重程度[24]。

本研究选择与人类RA 病理特征高度相似的胶原诱导法构建的CIA 大鼠模型,实验结果表明,Model 组大鼠出现体质量下降、足趾关节肿胀、精神状态异常等一般状况,经四妙汤干预后,大鼠体质量明显增加、足肿胀度降低、关节指数评分降低、滑膜组织病理状态明显改善。IL-6、TNF-α 作为引起RA 持续性滑膜炎的重要炎症反应标志物,其水平与RA 疾病程度存在正相关[25]。四妙汤干预后,可显著降低CIA 大鼠血清IL-6水平,显著降低滑膜组织中TNF-α 阳性表达。表明四妙汤能有效改善RA 病理症状,抑制RA 的炎症反应。

VD 缺乏与RA 发病率和严重程度有关[5]。人体获取VD 的形式是VD2和VD3,而VD2对维生素D 结合蛋白(DBP)的亲和力较低,生物利用度降低,因此VD在人体内发挥免疫作用的形式主要是VD3。VD3依靠位于肝脏的CYP27A1 羟化为25(OH)D3,产生活性1,25-双羟维生素D3[1,25(OH)2D3],由CYP27B1介导,1,25(OH)2D3可作用于VDR 发挥生物学效应。CYP27B1是维生素D活化的关键酶,CYP24A1是25(OH)D3、1,25(OH)2D3失活的羟化酶[26]。本研究结果显示,模型组大鼠血清25(OH)D3水平显著降低,滑膜组织CYP27B1、VDR 蛋白表达显著降低,CYP24A1 蛋白表达显著升高。四妙汤干预后,显著上调大鼠血清25(OH)D3水平及滑膜组织CYP27B1、VDR 蛋白表达,显著下调CYP24A1 蛋白表达。表明四妙汤可能通过调控维生素D 系统实现对RA 的治疗作用。

免疫系统的作用始终贯穿RA 的发生、发展,中性粒细胞作为固有免疫吞噬细胞[27],是人体非特异性免疫的重要组成部分,其经过刺激释放到细胞外的NETs在RA 中,是自身免疫抗原的重要来源,NETs 表达增加与RA 疾病状态相关[28],NETs 通过诱导ACPA 产生,刺激IL-6、TNF-α、白介素15(IL-15)等炎性因子的分泌,破坏机体免疫,参与RA 病理过程。NETs 的蛋白质组分NE 可降解关节软骨,加重RA 的炎症反应及骨破坏。NETs 及其产物MPO、NE 可作为RA 疾病活性标志物[29]。实验结果显示,模型组大鼠血清NETs水平显著升高,滑膜组织MPO、NE 蛋白表达显著升高,IHC 结果显示MPO 阳性表达显著升高,四妙汤高剂量及VD 干预后,则显著降低大鼠血清NETs 水平、滑膜组织MPO、NE 蛋白表达、MPO 阳性表达。表明四妙汤与VD 改善RA 与抑制NETs 的形成及其成分MPO、NE的释放相关。

综上所述,四妙汤可能通过调控VD 系统抑制NETs 的形成有效改善CIA 大鼠RA 病理症状,为临床治疗RA 提供了实验基础。

作者贡献:罗书曼负责文章的构思与撰写,数据处理及分析;朱星负责文章的质量控制及审校;罗书曼、陈帅、李文、董右青负责动物模型的制备、实验指标的检测;何昌禄、周艳负责文献和资料收集、整理,文章修订;陈云志提出实验的研究思路,负责实验的实施推进与可行性分析,对文章最终版本进行审核。

本文无利益冲突。

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