紫花苜蓿叶面积和叶解剖结构对盐胁迫的响应

赵 欣, 卢海峰, 钱 程, 胡雅飞, 刘大林, 王 琳, 李新娥

[1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009;2.扬州大学农业科技发展研究院(国际联合实验室),江苏扬州 225009]

紫花苜蓿 (Medicagosativa) 属于多年生豆科牧草,是我国调整产业结构、发展畜牧产业的主要牧草之一,也是目前保留种植面积最广的多年生牧草;其粗蛋白含量高,氨基酸种类齐全,总氨基酸含量较高,富含矿物质、碳水化合物、维生素等营养物质,适口性好,家畜喜食[1-2],有“牧草之王”的美誉[3-4]。此外,紫花苜蓿较强的固氮功能,可以有效改善土壤肥力[5-6],因此还可作绿肥。目前,土壤盐渍化是影响并限制农业生产的一个重要因素,我国盐碱地总面积达9 913万hm2,约占我国国土面积的10%,并且还在逐年增长[2,7-8]。而紫花苜蓿显现出较强的耐盐性,揭示紫花苜蓿的耐盐策略对进一步发展盐碱土地的饲草种植业具有积极作用。

植物叶片是连接植物和环境的重要器官[9]。环境变化常导致植物叶片基本形态及叶片解剖特征的响应与适应[10]。盐胁迫会导致植物的叶片扩展速率降低甚至停止生长,叶面积降低,比如乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis)[11]、空心莲子草 (Alternantheraphiloxeroides)[12]、深紫糙苏 (Phlomispurpurea)[13]等。比叶面积是叶单面单位面积与干质量之比,是一个涉及植物生态学的多功能方面的变量[14]。在有利的条件下,植物优化叶面积和比叶面积以获取光和养分;而在较高的盐浓度下,植物更倾向于将碳分配给叶质量和根,而不倾向于其表面[15]。

有关叶片解剖特征的研究显示,叶厚度最易受盐胁迫影响而产生差异,但研究结果并不一致。有研究指出盐胁迫会导致叶厚度增加,例如NaCl溶液处理下,空心莲子草[12]、三色堇(Violatricolor)[16]、木榄 (Bruguieragymnorhiza)[17]的叶片表皮厚度、叶肉厚度以及叶片总厚度都显著增加[18]。然而,盐胁迫处理的莴苣 (Lactucasativa) 叶厚度没有显著变化[19]。还有研究显示,紫花苜蓿[8]、辣椒(Capsicumannuum)[20]、草莓(Fragariaananassa)[21]在盐胁迫下叶厚度显著降低。还有一部分植物可以通过改善叶片内部结构的策略以适应盐胁迫的环境。栅栏组织和海绵组织厚度的比值 (栅海比) 是评价植物抗逆性的重要指标之一,叶片的栅海比越高,越有利于提高叶片内的气体交换和贮存,植物适应逆境的能力就越强[22-24]。例如,三色堇[16]、苦槛蓝 (Myoporumbontioides)[25]、木本苜蓿 (Medicagoarborea)[26]的栅海比在盐胁迫下显著增高。此外,叶片其他解剖结构指标,如暴露在单位细胞间隙中细胞壁的表面积 (Sm)、细胞壁的厚度、细胞间隙分数 (细胞间隙占叶肉总面积的分数,fias),这些指标均与叶肉导度有紧密的相关性,叶肉导度是胞间CO2到达叶片内羧化位点阻力的倒数。细胞壁越厚,细胞间隙的空间较小时,扩散的阻力就越大,叶肉导度就越小,这些指标在一定程度上影响着光合作用的效率[27-29]。有研究指出,盐胁迫会降低棉花 (Gossypiumspp.) 叶片的叶肉导度,这可能是叶片叶绿体面积降低、细胞壁厚度增加导致的结果,但是与叶肉导度相关的解剖结构如何变化并不清楚[30]。因此,需要进一步探讨盐胁迫对植物叶片解剖结构的影响。

目前,关于紫花苜蓿叶解剖结构所反映的抗盐性或耐盐性响应研究仍然不足,限制了我们对紫花苜蓿耐盐机制的了解。因此,本研究依托2个耐盐性不同的紫花苜蓿品种,采用温室盆栽试验,通过叶片扫描和石蜡切片技术,测量并计算紫花苜蓿叶面积、比叶面积、叶片横切解剖结构特征,拟探讨以下几个主要问题：(1)不同耐盐性品种紫花苜蓿叶面积和比叶面积对盐胁迫的响应;(2)不同耐盐性品种紫花苜蓿的叶片横切解剖特征对盐胁迫的响应;(3)不同耐盐性紫花苜蓿品种响应盐胁迫的主要特征指标。

1 材料与方法

1.1 研究地点及材料

试验选用2个紫花苜蓿品种,WL363HQ品种秋眠级为5,为抗寒高产多叶品种;WL712品种秋眠级为10,为南方高产优质品种,冬季生长活跃。试验初筛显示,WL363HQ耐盐性较强,而WL712耐盐性较差。试验采用盆栽方式 (花盆口径约17.5 cm,高度约16 cm,底径约14 cm),于2020年10月在扬州大学智能温室内(日均最高温度27 ℃,最低温度 15 ℃)播种。每盆均匀点播15 粒种子 (种子购买于北京正道种业有限公司),3叶期时进行间苗,留下 10株长势一致的健康幼苗,每7 d浇500 mL霍格兰营养液,每个品种各栽12盆。幼苗生长期,设置4个NaCl浓度梯度 (0、50、150、250 mmol/L),3组重复,每隔3 d浇100 mL NaCl溶液和对照蒸馏水。幼苗进行胁迫处理60 d后,于2021年1月中旬进行取样测量。

1.2 叶片解剖结构特征测定

每盆摘取5张成熟、健康的叶片,置于密封袋保鲜带回实验室,使用叶面积测定仪 (YT-YMJ02,山东云唐智能科技有限公司) 扫描叶面积后,称叶片鲜质量,称质量后将叶片用信封包好在105 ℃烘箱中杀青0.5 h,随后72 ℃烘干48 h直至叶片质量不再改变后,称取叶片干质量,用于计算比叶面积 (叶面积与叶干质量的比值,m2/g)。

另取相同位置的成熟健康叶片固定于FAA固定液中,4 ℃保存。将固定好的叶片用乙醇 (浓度梯度为50%、70%、85%、95%、100%) 脱水,每个梯度脱水30 ～ 60 min。二甲苯透明2次各30 min,浸蜡过夜,再用纯蜡置换2～3次,每次1 h左右,采用科迪KD-BMIII包埋机包埋,科迪KD-2260切片机切片,切片厚度为8 μm,番红-固绿双重染色,中性树胶封片后烘干。在Leica DM500-TR型显微镜及LIOO成像系统下观察、拍照。

用Image-J软件测量叶片的总厚度,上角质层、下角质层厚度,角质层总厚度,上表皮细胞、下表皮细胞厚度,表皮总厚度,栅栏组织、海绵组织、叶肉组织厚度,并分别计算栅栏组织、海绵组织、叶肉组织厚度占叶片总厚度的百分比。测量细胞间隙面积、细胞壁厚度、细胞间隙中细胞壁的总长度、切片横截面总面积(图1)。细胞间隙分数的计算方法[27]如下：

Sm的计算方法如下：

式中：fias是细胞间隙百分数;Sias是细胞间隙的面积,μm2;S为所计算切片的横截面积,μm2;Sm为暴露在单位细胞间隙中的细胞壁的表面积,μm2/μm2;lm为单位细胞间隙中的细胞壁总长度,μm;F是曲率修正因子,根据之前的研究取值为F=1.42[31]。

每个切片选3个视野测量,除细胞壁厚度以外,每个指标重复测量3次;细胞壁厚度随机选取显示在细胞间隙中的多个细胞,重复测量5次。

1.3 数据分析

在Excel 2019对数据进行录入和整理,用统计软件IBM SPSS Statistics 21对数据进行统计分析,进行单因素方差分析和邓肯氏多重比较。在分析中,上、下表皮厚度,表皮总厚度,栅栏组织、海绵组织、叶肉组织厚度,叶片总厚度进行了log转换以符合正态分布。本研究以α=0.05作为差异显著性判断标准。

此外,本研究对所有测量指标进行主成分分析(PCA)。主成分分析可以把多个互相关联的指标通过降维转换为较少的指标来综合反映其变化的信息,这些综合指标即为原来多个指标的主要成分,每个主成分的贡献率反映了从原始单一指标中提取的信息量。贡献率越大表明主成分中包含的原始信息越多[32]。很多研究应用主成分分析法将大量的性状特征转化为少量的综合特征,在产量、品质以及耐逆性状的筛选方面发挥了重要的作用[33]。

2 结果与分析

2.1 NaCl浓度对不同品种紫花苜蓿叶面积、比叶面积和叶厚度的影响

表1显示,WL363HQ品种的叶面积在对照组(0 mmol/L NaCl)最大,平均(2.5±0.3) cm2,随着NaCl浓度的升高,分别显著降低了12%、32%、36% (P<0.05);比叶面积无显著变化。而WL712品种的叶面积在盐胁迫后没有显著变化,比叶面积随NaCl浓度升高而升高 (P=0.073),最高在NaCl浓度为250 mmol/L时提高了21%。2个品种的叶片总厚度在对照组分别为(118.5±6.6)、(127.6±7.1) μm,在NaCl浓度为150 mmol/L时均显著提高 (P≤0.086),WL363HQ品种的叶片总厚度增加了32.2 μm,WL712品种增加了23.9 μm。从图1也可观察到在NaCl浓度为150 mmol/L时,2种紫花苜蓿的叶片总厚度最大。

表1 不同盐浓度对两种紫花苜蓿叶面积、比叶面积和叶厚度的影响

2.2 NaCl浓度对不同品种紫花苜蓿角质层和表皮厚度的影响

紫花苜蓿叶片为典型的异面叶,其解剖结构主要分为上下角质层、上下表皮细胞和叶肉组织,细胞间隙为叶肉组织中的间隙部分(图1)。由表2可知,各处理下WL363HQ、WL712的上角质层厚度分别介于4.2～5.1、3.2～5.0 μm,下角质层厚度分别介于4.9～5.5、3.1～5.9 μm,上表皮厚度分别介于12.9～14.2、11.7～15.6 μm,下表皮厚度分别介于12.4～13.7、12.0～15.3 μm。NaCl浓度升高对WL363HQ的上下角质层厚度没有产生显著影响,对表皮厚度的影响也不显著,但总体都是减小的趋势。然而,WL712品种的下角质层、总角质层的厚度都随着NaCl浓度的升高而显著降低 (P<0.05),下角质层、角质层总厚度在NaCl 浓度为250 mmol/L时分别显著降低了47%、39%;上角质层没有显著的变化,但也呈现下降的趋势;对其表皮而言,除上表皮厚度在NaCl浓度为150 mmol/L时显著上升了33%外 (P<0.05),下表皮和总表皮厚度均无显著变化。

表2 不同NaCl浓度对两种紫花苜蓿叶片角质层和表皮厚度的影响

2.3 NaCl浓度对不同品种紫花苜蓿叶肉组织厚度和叶肉导度相关指标的影响

叶肉组织由栅栏组织和海绵组织构成。由表3可知,WL363HQ品种的栅栏组织厚度在对照处理中的厚度为(43.5±2.8) μm,NaCl浓度为150、250 mmol/L 时分别显著增加了35%、46%(P<0.05),叶肉组织厚度也从对照组的(86.3±5.6) μm显著增加了31%、25% (P<0.05),而海绵组织厚度无显著变化,由此造成了栅栏组织厚度百分比、栅海比、叶肉组织厚度百分比均显著增加(P<0.05),而海绵组织厚度百分比则显著下降 (P<0.05)。然而,对于WL712品种而言,除了栅栏组织厚度在NaCl浓度为250 mmol/L时比对照组显著降低了16% (P<0.05),海绵组织、叶肉组织厚度无显著变化,3个百分比指标以及栅海比也均无显著性差异。

表3 不同NaCl浓度对两种紫花苜蓿叶肉组织厚度和叶肉导度相关解剖指标的影响

Sm、fias、细胞壁厚度都是影响叶肉导度的重要因素之一。盐胁迫处理以后,WL363HQ品种的Sm、fias变化均不显著,总体上在NaCl浓度为50、150 mmol/L时较高于对照和最高浓度;细胞壁厚度在对照处理时最大,为(0.9±0.1) μm,在NaCl浓度为150、250 mmol/L时显著降低,分别降低了22%、33% (P<0.05)。WL712品种的Sm随浓度升高逐渐降低,在NaCl浓度为250 mmol/L 时较对照降低了26%(P<0.05);细胞间隙分数在NaCl浓度为 50 mmol/L 时较对照显著提高了48%,在 150 mmol/L 时较对照提高了12%,但在高浓度 250 mmol/L 时与对照无显著性差异(P≥0.05);WL712的细胞壁厚度在各浓度盐胁迫处理下的变化均不显著。

2.4 紫花苜蓿叶解剖指标的主成分分析 (PCA)

将2个品种的所有测量特征指标分别进行主成分分析 (图2),各指标与前4个PCA主轴的特征值、贡献率、累计贡献率如表4所示。品种WL363HQ的前4个主成分轴的累计贡献率达到81.21%, 即能解释所测定指标的81.21%的变异。

表4 2个紫花苜蓿品种叶解剖指标的前4个主成分的特征向量、特征值、贡献率及累计贡献率

第1主成分轴的贡献率最大,达到了30.00%,主要与叶肉厚度 (MT)、叶厚度 (LT) 、栅栏组织厚度 (PT) 具有较强的相关性,相关系数分别为0.40、0.37、0.40;第2主成分轴的贡献率为22.86%,主要由上表皮厚度 (UET)、表皮厚度 (TET) 和栅栏组织厚度百分比 (MT%) 决定,相关系数分别为0.33、0.39、0.35。

WL712品种的前4个主成分轴的累计贡献率达到79.44%。第1主成分的贡献率达到28.00%,主要由叶肉组织 (MT)、角质层厚度 (TCT)、叶厚度 (LT) 决定,相关系数分别为0.38、0.33、0.33;第2主成分的贡献率为22.25%,主要由上表皮厚度 (UET)、下表皮厚度 (LET)、表皮总厚度 (TET) 决定,相关系数分别为0.35、0.40、0.44。

3 讨论

3.1 紫花苜蓿叶面积、比叶面积和叶厚度对盐胁迫的响应

植物叶面积的大小决定着植物光合辐射的有效面积[34],与干物质产量具有密切的关系。WL363HQ的叶面积随NaCl浓度的升高而降低,这与之前的很多研究[11-12]一致。长期盐胁迫下植物的能量消耗可能大于能量产生,因此需要减少对叶片扩张的能量投入。较小的叶面积使得植物体的蒸腾面积进一步降低,失水速率减小,故抵御盐胁迫及防止灼烧的能力也不断增强,这是一种避盐机制,这种机制可以限制盐离子在植物地上部分的积累,并将蒸腾作用造成的水分损失降至最低[18]。与WL363HQ不同的是,WL712的叶面积没有产生较大的变化,但比叶面积在受到盐胁迫后显著增加了,在NaCl浓度为250 mmol/L时增加最明显。比叶面积增加这种反应有利于更大的全植物碳增益,从而有助于这个品种在盐碱易发地区获得更好的农艺性能[35]。

2个品种的叶厚度在盐胁迫后都显著地增加了,并在NaCl浓度为150 mmol/L时最明显,浓度持续升高、叶厚度下降。叶厚度与叶片的储水能力有关[36]。厚叶通常具有较高的叶绿素,且叶厚度也是与植物产量紧密相关的特征[37]。在高盐浓度下,更高的叶厚度有助于稀释细胞液中的盐浓度,调节渗透平衡[19],并且可以平衡叶面积减小对干物质产量带来的消极影响。

3.2 紫花苜蓿角质层和表皮厚度对盐胁迫的响应

叶片表皮是位于叶片表面的一层细胞,角质层是位于叶片表皮外的一层疏水膜,和表皮细胞共同为叶片器官提供支撑和保护[38]。上表皮是叶片的向光面[39],叶片上表皮厚度对叶片表面光的反射和折射具有密切联系,较低的厚度更利于光的透射[40],但较高的表皮厚度对叶片起到了一个很好的支撑作用。角质层厚度可以赋予叶片机械强度,较厚的角质层更耐撕裂,撕裂力与角质层厚度成正比[41]。本研究结果显示,WL363HQ品种的角质层、表皮特征均没有显著的变化;而WL712品种紫花苜蓿的角质层厚度在高盐胁迫中显著减低,这种变化不利于植物对水分的保护以及维持叶片的正常形态,其上表皮厚度在NaCl浓度为150 mmol/L时增加,说明其叶片的光合有效辐射受到的影响较大,最终可能导致叶片扩张延缓,生物量减少等结果。

3.3 紫花苜蓿叶肉组织及叶肉导度对盐胁迫的响应

叶肉栅栏组织越厚,意味着最大单位体积内叶绿体数量越多,叶片可进行光合作用的位点更多;叶肉海绵组织越厚,海绵组织的比率越小,表示叶肉组织越紧密,细胞间隙所占的比率越小,从而减少蒸腾作用的水分散失和保证更高的水分利用效率[42]。因此栅海比越高越有助于缩短CO2到达叶绿体的距离[18],使叶片的光合效率得到显著的提升[43]。试验结果表明,WL363HQ品种的栅栏组织厚度和相对比例随NaCl浓度增加而显著增加,而海绵组织厚度百分比降低,栅海比升高,这些变化反映出其对高盐浓度的适应,是一种保护光合作用过程的适应性反应,该结果与在高浓度盐胁迫下具有更高栅海比的三色堇一致[16]。然而,WL712品种的栅栏组织厚度在NaCl浓度为150 mmol/L时达到最大,但NaCl浓度达到250 mmol/L时栅栏组织厚度降低,这表明WL712品种对高盐胁迫的适应性不如WL363HQ品种。

叶肉导度是CO2在叶肉细胞内传输阻力的倒数,其大小主要取决于叶片的结构[44],是影响叶片光合速率的关键性状[29]。研究结果显示,WL363HQ品种的细胞壁厚度随NaCl浓度升高而减小,而更薄的细胞壁表明叶肉细胞具有更大的CO2导度,有助于提高叶片的光合速率。而WL712品种的Sm随NaCl浓度的升高而降低,fias、Sm与通常叶肉导度呈正相关关系[45-46],因此其叶肉导度也可能随之下降。这个结果也证明,相较于WL363HQ品种,WL712品种受到盐胁迫的负面影响可能更严重,不适宜在高盐浓度的环境下长期生存[44]。

3.4 2个紫花苜蓿品种响应盐胁迫的主要特征指标

主成分分析结果显示,WL363HQ品种的栅栏组织厚度、叶肉厚度、叶总厚度是叶片在盐胁迫中响应的主导特征,主要反映了叶片能量分配的特征,这是影响紫花苜蓿产量的重要性状,说明提高WL363HQ品种的耐盐性主要是提高叶片的叶肉厚度、栅栏组织和叶厚度。以前的研究也显示,在盐胁迫条件下,植物提高叶厚度和栅栏组织厚度有利于提高其生物量和存活率,叶片可以通过改变厚度来调节单位面积的生物量[47]。

WL712品种的第1主成分中,叶肉组织厚度、栅栏组织厚度、角质层厚度的绝对值较大;第2主成分中,上下表皮、表皮总厚度的绝对值较大。因此,角质层厚度、表皮厚度是WL712品种响应盐胁迫的主要特征,角质层厚度的变化与叶片的机械强度、水分屏障有关,这些特性与植物在逆境中的生存紧密相关[38,41]。在高盐浓度下WL712品种的角质层厚度减小和表皮厚度增加是影响其生长发育的主要原因。

4 结论

综上所述,耐盐性较强的品种WL363HQ叶片的主要耐盐策略包括减小叶面积、提高叶片栅栏组织厚度,从而增大光合器官的投入、减少海绵组织的相对厚度以缩短CO2的扩散距离,通过减少细胞壁厚度提高叶肉导度,从而最终提高光合效率以适应盐胁迫环境。然而,耐盐性较差的品种WL712虽然表现出了比叶面积和叶厚度增大的特征以积极响应盐胁迫,但其叶片在高盐浓度时角质层厚度降低,叶厚度、栅栏组织厚度降低,这些变化均不利于对盐胁迫环境的适应,最终不利于其在高盐浓度下生长发育。研究结果揭示了2种不同耐盐性紫花苜蓿品种在盐胁迫环境下的主要叶片策略。