血栓调节蛋白在肾脏疾病中的作用与机制

向文柳,柯 本,房向东

(南昌大学a.研究生院医学部2020级; b.第二附属医院肾内科,南昌 330006)

慢性肾脏病(CKD)是一种进展性的无法治愈的疾病,具有高发病率和高病死率的特点,已成为全球重大的公共卫生问题[1]。CKD最常见的继发性因素是糖尿病和高血压,其次是缺血、原因不明的肾小球硬化、泌尿系统阻塞和慢性感染等[2],其最常见的病理结果是肾脏纤维化[2]。一般来说,透析和肾移植是大多数终末期肾脏病(ESRD)患者的最佳选择,但同时也给患者带来了巨大的经济负担[2]。因此,迫切需要找到一种有效的预防和缓解肾纤维化的药物。

血栓四项是血栓形成和纤溶系统激活的分子标志物,已被广泛应用于临床检测[3]。血栓四项包括凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物(PIC)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(t-PAIC)。其中血栓调节蛋白是临床治疗弥散性血管内凝血(DIC)的特效药物[4],但实际上它还有很多其他的意义与临床应用[5-7]。血栓调节蛋白是一种跨膜糖蛋白,其可溶形式可以作为内皮细胞受损伤的标志物之一[8],是血管内皮细胞在炎症及缺氧状态下,代谢失衡致血管痉挛、相应组织缺血缺氧,水解释放产生具有不同长度的血栓调节蛋白胞外部分的可溶性片段[9],其与各系统疾病有着密切的联系。本文对近年来关于TM在肾脏病治疗中的研究进展进行综述,旨在揭示TM的肾脏保护作用机制,从而为肾脏疾病的治疗提供一种新的思路。

1 TM和可溶性血栓调节蛋白(sTM)

1.1 TM的生物学功能

TM是一种内皮细胞结合膜糖蛋白,除在血管内皮细胞中表达外,在系膜细胞、树突状细胞、单核细胞,甚至心肌细胞中也有少量表达[5]。TM包括5个分子结构域:N-末端C型凝集素样结构域(D1)、6个表皮生长因子(EGF)样结构域(D2)、1个富含苏氨酸/丝氨酸的结构域(D3)、1个跨膜部分(D4)和1个细胞质尾(D5)。

TM是一种明确的抗凝物质,其抗凝机制为:1)TM可与蛋白酶激活受体(PARs)竞争凝血酶上的结合位点,从而减少血小板的活化;2)通过与凝血酶形成复合物,使凝血酶丧失活化纤维蛋白原的能力;3)形成的凝血酶-TM-PC复合物,使PC的活性显著提高,同时在蛋白S作用下,灭活Va和Ⅷa并结合Xa,抑制Xa活化凝血酶原,从而抑制内外源凝血反应。D2结构域是TM和凝血酶结合的关键位点,其包括6个表皮生长因子样结构域,即EGF1-6[7]。其中,EGF4-6结构域在TM和凝血酶结合形成高亲和力抗凝血酶复合物以及随后的PC和凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)的活化中发挥至关重要的作用[7,10]。TM对纤溶系统的调节具有两面性:一方面,活化的TAFI通过去除纤维蛋白原中赖氨酸残基来抑制纤维蛋白溶解,从而减少纤溶酶原向纤溶酶的有效转化[11];另一方面,凝血酶-TM-PC复合物通过抑制凝血酶的生成减少TAFI的激活而发挥促纤溶作用。此外,活化的TAFI还可以使促炎介质、缓激肽[12]及补体C3a和C5a[13]失活。因此,TM通过凝血酶介导的PC和TAFI活化,实现对血栓形成、纤维蛋白溶解、炎症和细胞凋亡的调控作用[14]。

TM的抗炎作用:1)通过TM-凝血酶复合物激活PC,活化的APC是一种重要的抗炎分子;2)抑制补体系统的激活;3)抑制白细胞介导的血管内损伤;4)中和损伤分子相关模式(DAMPs),包括高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)和组蛋白。D1结构域是TM发挥抗炎作用的关键部位[15]。D1结构域可以阻止HMGB-1与多种细胞表面受体结合,如Toll样受体-2(TLR2)、Toll样受体-4(TLR4)及晚期糖基化终产物受体(RAGE),从而阻止HMGB-1的炎性损伤作用[5]。HMGB-1是损伤分子相关模式(DAMPs)的一种,在细胞受到损伤或死亡的时候释放,触发促炎信号通路、活性氧的产生和NF-kB激活从而引起急性器官损伤[16]。

D3是硫酸软骨素的结合位点,其可以增强TM和凝血酶的结合,使TM对APC活化的亲和力提高10倍[17]。此外,D3结构域还可通过结合补体因子H来减弱替代补体级联的激活来间接地发挥抗炎作用[18]。TM的D4和D5结构域提供了TM和胞外结构域的桥梁,并在细胞迁移中发挥作用[7]。

1.2 sTM的生物学功能

在内皮细胞受损或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)存在的炎症环境中,TM的跨膜成分被释放至血液,称之为sTM,此时的TM分子失去其血管保护活性[6]。生理情况下,TM的血浆浓度相对较低,但当内皮细胞受损时,其血浆浓度可增加1.5～2.0倍,提示sTM水平升高与内皮细胞受损可能呈正相关[6]。然而,OLIVOT等[19]认为,血浆高浓度sTM是否是内皮损伤的标志应根据血管环境来判断。与此同时,SALOMAA等[20]也认为,在病理条件下,较高的sTM水平可能是受损的内皮细胞上TM被水解的结果,此时的sTM浓度可能表明内皮细胞受到损伤;而在健康个体中,较高水平的sTM浓度可能反映的是内皮细胞较高的分泌TM的能力,此时的sTM浓度可能提示的是低血栓形成状态。因此,SALOMAA等[20]得出结论,只有在病理条件下的sTM浓度才反映血管内皮细胞受损的程度。

尽管sTM作为血管内皮损伤的标志物的观点已被大家普遍认可,但当肾功能或肝功能受损时,sTM浓度也会随之升高,这意味着sTM水平的变化与肝、肾功能损伤之间可能存在着一定联系[6]。

2 TM和肾脏疾病

2.1 TM与CKD

无论什么原因导致的CKD,以肾小管间质纤维化和肾小球硬化为特征的肾纤维化都是其最终的病理结果[2]。持续损伤后无法控制的炎症、基质生成细胞的激活和扩增、纤维化信号的传导和执行,最终导致了纤维化的形成和发展[21]。其中,活化的肌成纤维细胞被认为是细胞外基质的主要分泌细胞,肾小管上皮细胞和内皮细胞的上皮-间充质转化(EMT)是肌成纤维细胞的主要来源[21]。转化生长因子β1(TGF-β1)是公认的最主要的致纤维化因子[21]。有研究[21]表明,阻断TGF-β1信号通路可以阻止肾小管上皮细胞EMT进程,减少细胞外基质的产生,从而减少肾纤维化。

一项有关肺纤维化的研究[22]证实了rhTM和TGF-β1信号通路介导的EMT之间的作用关系,实验数据表明rhTM可以抑制TGF-β1介导的肺纤维化的发生和发展并抑制肺上皮细胞的凋亡。那么rhTM在肾纤维化上是否具有同样的疗效呢?TAKESHITA等[23]的实验结果显示,相对于对照组,rhTM治疗组的TGF-β1转基因小鼠各项肾功能指标都有所改善,并且有效地抑制了足细胞的凋亡和EMT,从而明显地缓解了小鼠的肾脏纤维化。通过肾小球特异性人TGF-β1转基因小鼠模型的建立,该实验还表示rhTM对EMT和足细胞的凋亡的抑制作用可能和体内TGF-β1信号通路的调节有关[23]。有研究[24]表明,Bub1的缺乏可以减少对TM表达的抑制,从而降低炎症因子TNF-α水平和纤维蛋白的表达,通过抑制炎症和纤维化的发生有效地降低了脓毒症小鼠的死亡率。苯并咪唑相关蛋白1(Bub1)是一种细胞周期相关蛋白,当Bub1缺乏时,TGF-β1和TGF-β2的异二聚化受阻,从而阻止了TGF-β1信号传导。因此,TGF-β1信号通路的调节可能是TM抗纤维化的重要机制。此外,KANAZAWA等[25]表示rhTM可以明显改善肾纤维化,经rhTM预处理的大鼠纤维化和炎性指标的上升幅度明显下降。通过观测凝血酶结合受体PAR1的表达变化发现,rhTM还可能通过调控PAR信号通路来抑制凝血酶对成纤维细胞的促纤维化和促炎作用,从而发挥抗纤维化作用。

综上所述,rhTM对肾纤维化具有明确的抑制作用,其机制可能与抑制TGF-β1信号通路的传导以及对体内抗炎和抗凝系统的调控有关。

2.2 TM与脓毒症相关性急性肾损伤

急性肾损伤(AKI)是脓毒症的常见并发症,也是脓毒症高发病率和高病死率的重要原因[26]。AKI和CKD间存在强烈的流行病学联系,AKI的延迟恢复是导致CKD的重要原因之一[27]。及早预防和治疗AKI可以有效的防治CKD的发生。

近些年,细胞外组蛋白被认为是脓毒症死亡的主要介质而引发人们的关注,其在细胞损伤或死亡的时候被释放,可通过对肾小管上皮细胞的直接损伤作用或通过TLR2/TLR4的间接相互作用导致肾脏损伤[28]。靶向降低细胞外组蛋白水平似乎是改善AKI预后的一种有效方式。AKATSUKA等[28]通过盲肠结扎和穿刺法(CLP)成功建造脓毒症大鼠模型。经观察术后24 h组蛋白H3水平、肾脏组织病理学变化及存活率,发现细胞外组蛋白H3的水平随着时间的推移而升高,且与病理诊断和肾功能检查的肾损伤及高死亡率有关[28]。与未治疗的脓毒症大鼠相比,给予rhTM和D1结构域可显著降低循环组蛋白H3水平、减少肾脏损伤并显著降低死亡率。rhTM治疗组和D1治疗组相比差异无统计学意义。该实验不仅证明了组蛋白H3水平升高与肾脏损伤呈正相关,还证明了rhTM尤其是D1结构域通过降低细胞外组蛋白H3水平抑制了脓毒症大鼠的炎症反应,保护肾功能,提高了脓毒症大鼠的存活率[28]。

此外,一项内毒素(LPS)诱导的AKI小鼠模型的实验[29]结果也证实了rhTM抗炎效应对脓毒症相关AKI的保护作用。该实验结果显示,rhTM显著抑制LPS注射后的肾毒性,抑制炎性细胞的聚集,降低LPS诱导的促炎细胞因子和趋化因子的上调,从而减轻脓毒症小鼠的肾损伤。

2.3 TM和缺血性肾损伤

血液灌注量大是肾脏生理的一大特点,当肾脏血流不足时容易导致缺血性肾损伤。缺血性肾损伤后局部肾脏的血流动力学改变持续存在,并在肾脏的再灌注损伤中发挥关键作用[30]。缺血/再灌注是导致AKI的重要原因[31]。重大手术或严重创伤容易导致肾脏血流不足,是导致缺血性肾损伤的重要原因[32]。另外,缺血性肾损伤还是器官移植的常见并发症,有研究[33]表明,缺血性肾损伤是移植器官功能受损的常见原因,与急性排斥事件增加和晚期同种异体移植器官失败密切相关。预防和早期治疗被认为是减少缺血/再灌注肾损伤的关键措施。

TM被证明可以减轻肾缺血低灌注模型中的缺血性肾损伤。在缺血性肾损伤模型中观察到,血清肌酐和尿素氮水平明显增加,中性粒细胞明显浸润,肾皮质管周毛细血管缩小,血流严重受阻[34]。OZAKI等[34]的实验结果表示rhTM的应用可以明显改善上述情况。此外,另一项研究[35]也提示了TM对缺血性肾损伤的保护作用。其结果显示,sTM预处理显著缓解了缺血诱导的肾功能障碍和肾小管损伤,而再灌注后2 h sTM的应用可在24 h内避免因缺血引起的肾功能障碍并提高存活率。证明TM的早期干预可能会降低肾脏损伤发生的危险,提示TM作为缺血性肾损伤药物靶点的潜力。

2.4 TM与糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)已成为导致ESRD的主要原因[36]。内皮细胞损伤是糖尿病肾病的重要机制,可导致微循环障碍、炎症和纤维化[37]。有研究[37]结果显示,PC依赖于TM被活化后,可通过调节固有的线粒体凋亡途径来抑制肾小球内皮细胞和足细胞的凋亡,从而保护肾脏免受高血糖损伤。TM作为内皮细胞跨膜糖蛋白,在内皮细胞受损后导致的肾脏损伤中可能发挥着重要作用。

TM可抑制肾小球炎症状态,从而缓解DN进展。临床研究[38]显示,无论糖尿病患者是否进展为DN,当TM表达下降时都会出现相应的肾小球炎症增加的现象。在DN小鼠模型中,当TM表达下降时,血清APC数量下降,从而使肾小球细胞凋亡、肾小球硬化增加,加速DN进展[38]。不仅如此,选择性内皮素A受体(ETAR)阻滞剂阿特拉森坦治疗糖尿病小鼠后,小鼠的TM表达得到恢复并且肾小球炎症状态也得到明显改善[38]。这意味着TM可通过修复肾小球内皮细胞损伤,缓解DN进展,且上调TM的表达水平可有效地防治糖尿病患者进展为DN。

活性氧(ROS)和炎症是DN发展的重要机制[39],此外,足细胞凋亡也能促进DN的发展[39]。NRF2通过抗氧化应激来发挥对DN的保护作用[39]。NF-κB和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)是DN发病机制中重要的炎性介导物质[39]。YANG等[39]的实验通过将腺病毒(AAV)携带的TM-D1结构域基因导入小鼠体内来评估TM-D1的治疗潜力和相关机制。该实验不仅证明了TM-D1通过抑制NF-κB和NLRP3炎症体的激活从而发挥非APC依赖的抗炎活性;还证明了TM-D1可通过增强NRF2抗氧化途径和抑制肾脏足细胞凋亡来改善肾脏损伤、保护肾功能。

综上所述,TM可通过多种途径抑制肾小球炎症状态及ROS产生,抑制肾小球血管内皮细胞损伤及足细胞凋亡,从而延缓DN进展。

2.5 TM与抗肾小球基底膜肾炎

抗肾小球基底膜肾炎(Anti-GBM-GN)是一种以快速进展的肾功能衰竭为临床特征,并在组织学上表现为炎性组织浸润及坏死性新月体肾小球病变的一种疾病,其病理机制主要由单核/巨噬细胞和CD8+T细胞的浸润介导[40]。虽然皮质类固醇和其他免疫抑制剂对部分新月体肾炎患者有效,但使用这些药物增加了感染和死亡风险,因此研发一种更安全有效的治疗药物仍是刻不容缓。

TACHIBANA等[16]通过向大鼠注射肾毒性血清(NTS)诱导抗GBM-GN大鼠模型,并探讨rhTM是否可以通过抗炎作用来缓解抗GBM-GN的发展,结果显示,rhTM可显著降低肾小球新月体和纤维素样坏死的比例,显著减少巨噬细胞的聚集及促炎细胞因子的表达并显著降低肾脏和尿液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。ICAM-1是诱导巨噬细胞聚集从而导致抗GBM-GN形成的关键因子,也是HMGB1发挥促炎作用的介质。除此之外,rhTM还显著降低了抗GBM-GN大鼠肾皮质Toll样受体-2(TLR2)、Toll样受体-4(TLR4)及其下游蛋白MyD88的mRNA水平[16]。Toll样受体(TLRs)是体内的免疫传感器,在肾脏的多种细胞上广泛分布,可通过识别HMGB1分子来激活体内髓样分化因子88(MyD88)依赖的信号通路,最终导致NF-κB的激活,从而介导促炎细胞因子和趋化因子的表达[25]。因此,rhTM具有保护抗GBM-GN大鼠肾脏功能的潜力,且其机制可能与抑制体内的HMGB1/TLR/MyD88信号通路从而降低体内的ICAM-1水平有关。

虽然目前TM在抗GBM-GN中研究较少,但随着对TM机制的深入研究,TM在抗GBM-GN治疗中的潜力也越来越使人信服。抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关的血管炎(AAV)是一组以中小血管的炎症和破坏以及循环ANCA的存在为特征的疾病,超过75%的肾脏受累患者以快速进展性肾小球肾炎为特征[41]。李颖等[42]研究表明AAV患者外周血管存在血管内皮细胞TM和内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)弥漫性下降,两者下降程度在AAV不同亚型之间存在差异。过敏性紫癜性肾炎(HSPN)是常见的继发性肾脏疾病。持续高水平的血浆TM可能与HSPN患儿肾脏病变有一定关系,HSPN患儿的肾组织均见TM阳性表达,且HSPN患儿血浆TM与肾组织TM呈正相关[43]。在血栓性微血管病(TMA)患者研究中发现,TMA患者存在TM、纤溶酶原和PC相关蛋白甘油二酯酰激酶ε的遗传异常[44],说明TM可能参与了TMA的发病机制。对于具有抗补体因子H抗体的TMA患者来说,抗补体治疗是一种有效的初始疗法[45],在这方面TM可能具有一定的疗效。此外,通过在TMLeD/LeD转基因小鼠(缺乏TM D1结构域)膀胱内接种尿路致病性大肠杆菌来建立肾盂肾炎模型发现[46],TMLeD/LeD小鼠显示肾脏局部促炎细胞因子生成和中性粒细胞浸润减少,表明TM D1结构域在急性肾盂肾炎的防御中起关键作用。

3 sTM与肾脏疾病

如前所述,sTM是内皮细胞受到损伤时释放出的TM跨膜物质,此时的sTM不再具备血管保护活性,而是作为内皮细胞损伤标志物用作某些疾病发生的预测因子。本综述总结了以下几种sTM可能预测的疾病。

sTM作为AKI的独立预测因子并可判断预后。KATAYAMA等[47]研究了血管内皮细胞损伤标志物(Symdecan-1和sTM)与AKI发生率、严重程度及持续时间之间的关系。结果表明,血浆Symdecan-1和sTM浓度的升高与严重创伤后AKI的发生率和严重程度增加以及持续时间延长有关,且血浆sTM水平可能是肾功能不全更好的指标[47]。此外,一项来自FINNAKI观察性研究[48]的数据显示,sTM与90 d病死率增加独立相关,并支持sTM是AKI独立预测因子的结论。

sTM可监测慢性肾脏病病情的严重程度,尤其是作为心血管风险的标志物。一项儿童慢性肾脏病调查研究[49]发现,在sTM水平显著升高的儿童中,其蛋白尿水平、尿素氮、肌酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度以及公认的氧化应激标志物氧化型低密度脂蛋白水平也显著升高,且肾小球滤过率水平下降。这提示sTM似乎是慢性肾脏病内皮功能障碍的一个有价值的标志物,与CKD分期、肾功能参数(尿素、肌酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)密切相关。此外,一项关于终末期肾脏病患者动脉壁血管疾病新指标的研究[50]表明,sTM可能参与了晚期肾病患者血管重构和钙化的早期过程,在日常临床实践中可以作为ESRD患者心血管风险的简单标志物。

sTM可作为监测狼疮性肾炎(LN)疾病活动性的指标。在一项LN患者的研究[51]中,结果显示,与活动期LN的常规血清标志物如dsDNA抗体滴度升高和C3水平降低相比,sTM在区分活动期LN和静止期LN方面更敏感且特异性更高。

因此,血管内皮细胞损伤标志物sTM,不仅可以作为AKI的独立预测因子和CKD患者心血管疾病的风险预测因子,在判断LN患者病情活动性方面也显示巨大潜力。

4 结论

综上所述,TM不仅通过多途径、多机制发挥凝血、抗凝及纤溶作用,也可以作为疾病严重程度和预后指标来探寻疾病的发病机制,同时还可以应用于疾病的治疗。多项动物实验研究也暗示rhTM巨大的肾脏保护潜力。面对当前肾脏病给全球带来的巨大负担,医学工作者有责任和义务寻找一种有效的治疗方案,而TM很有希望成为防治肾脏疾病的新药物。