白刺花幼苗抗旱与耐寒协同响应的生理生化评价

吴丽芳，魏晓梅，蔡 建

曲靖师范学院生物资源与食品工程学院/云南省高校特色果酒技术创新与应用工程研究中心，云南曲靖 655011

近年来，极端气候频繁出现，植物为了能够适应赖以生存的环境，从形态结构、生理生化、细胞和分子水平等层面均会表现相应的响应。活性氧（ROS）产生和积累是植物逆境胁迫下最初反应[1]，正常环境下，植物细胞ROS产生与清除可通过抗氧化酶系统维持在相对动态平衡水平，当受胁迫时，这种平衡会遭到破坏而使ROS积累导致氧化应激，进而使生物膜造成损害，光合受阻，呼吸作用异常，酶系统失活等[2-3]。为有效控制ROS过度积累引起的氧化应激，植物已进化出酶促系统（SOD、POD、CAT、APX、DHAR、MDHAR、GPX、GR、GOPX等）和非酶促系统（抗坏血酸、脯氨酸、谷胱甘肽等）以清除ROS[4-5]，有研究表示，适度干旱胁迫下，白刺花[6-7]、胡枝子[8]、樟树[9]、油茶[10]等植物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）出现上升趋势，表现相互协调的作用方式；当干旱加重，保护酶系统反而下降。然而，不同学者对不同的植物干旱胁迫下酶活性变化有一些差异，蒙古莸[11]持续升高，而菜豆树和锯叶竹节树[12]反而下降。脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白为干旱胁迫下植物细胞积累的渗透调节物质，其可能作用机理是维持植物细胞较低的渗透势，保持水分，以提高抗逆性[12]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是膜质过氧化的产物，受SOD酶活性大小所调节[13]，含量高低反映了膜系统的受损程度，干旱胁迫下，增幅越大，抗旱性越差，反之，则抗旱性越强，其可作为衡量植物耐旱性强弱的重要指标参数[14]。

白刺花（Sophora davidii）又名铁马胡烧、狼牙刺、苦刺花，为豆科蝶形花亚科苦参属（APGⅣ分类）灌木，在当代其主要分布区位于云南、广西、贵州、西藏、四川等地[15]。以往对白刺花抗旱性有许多报道，王海珍等[16]、王红梅等[17]、李芳兰等[18]、田方等[19]从形态特征、渗透调节物质、保护酶系等研究认为，干旱胁迫时，白刺花保护酶系能相互配合协同作用，以降低膜脂过氧化，维持细胞膜完整性，具有较强的抗旱性。然而，以往的研究多集中于利用PEG模拟干旱环境对种子萌发或盆栽实验人工控水模拟水分胁迫得到的结果，对土壤自然缺水的连续观测研究仍相对缺乏，研究土壤自然干旱的生理生化特征更接近于田间植物干旱的真实响应。植物的抗逆性往往有协同效应，刘海卿等[20]对白菜型冬油菜的研究中得出抗寒性强的品种一般抗旱性也比较强。董绪兵等[21]对黄瓜的研究中也得出类似结论，干旱预处理可诱导黄瓜幼苗对低温胁迫的交叉适应性。植物的“交叉适应”在玉米[22]、葡萄[23]等已有报道，而有关白刺花干旱-低温交叉适应的研究尚未见报道。基于此，本研究采用盆栽试验法，研究白刺花实生苗自然干旱胁迫处理再进行低温处理后幼苗叶片相对含水量（relative water content，RWC）、MDA含量、脯氨酸（proline，Pro）含量及抗氧化酶系变化，旨在探讨干旱-低温协同响应的生理机制，为抗旱与抗寒性的综合评价提供可借鉴的方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

种子采集：白刺花种子于2020年11月采集于云南省曲靖市沾益县西平镇九孔桥阳坡面，连壳采集带回实验室脱壳，挑选无虫眼饱满的种子于2021年5—12月种植于曲靖师范学院玻璃温室内。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 将白刺花种子划破种皮经次氯酸钠消毒后播于直径25 cm的黑色塑料育苗袋中，每袋装腐叶土和红壤土各3 kg，再伴微生物肥0.5 g，每袋定植2株，播后每2 d浇水1次。

1.2.2 干旱胁迫处理 待实生苗生长90 d后采用自然干旱控水处理。在干旱试验前浇透水，盆土渗出水即为达到饱和。停灌后2、4、6、8、10、12、15 d对植株进行采样，常规管理为对照。采用随机采样的方法，分别测定叶片相对含水量、叶绿素、Pro、MDA、SOD、POD、CAT活性，每个指标重复3次。试验中，2~4 d为胁迫初期，6~10 d为胁迫中期，12~15 d为胁迫后期。

1.2.3 耐寒性胁迫处理 将经过自然干旱处理过的植株复水后常规管理，再生长90 d后采用人工控温方法进行低温胁迫，设置5 ℃低温于人工气候箱培养，光周期16 h/8 h，光照强度为1500 lx，于处理5、10、20、30 d进行采样，以未经干旱和低温处理为对照，分别测定Pro、MDA、SOD、POD、CAT活性。

1.2.4 指标测定 按照邹琦[24]和李合生[25]植物生理学实验指导方法测定生理生化指标，磺基水杨酸茚三酮比色法测定Pro含量；氮蓝四唑光还原法测定SOD活性；愈创木酚显色法测定POD活性；紫外吸收法测定CAT活性；硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。紫外可见分光光度计比色法测定叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和类胡萝卜素（Car）的吸收值并计算Chla、Chlb、Car和Chla/Chlb、Chl/Car含量。称重法测定叶片含水量。

1.3 数据处理

采用Excel 2016软件进行数据统计分析，SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下白刺花幼苗生长及叶片含水量变化

白刺花幼苗具有一定的干旱耐受能力，胁迫初期（2~4 d）幼苗长势良好，胁迫中期（6~10 d）部分叶片卷曲，胁迫后期（12~15 d）大部分植株叶片内卷，基部叶片变黄下垂或脱落，叶尖生长点枯萎，当复水2 d后，植株又能恢复生长。干旱缺水下白刺花叶片相对含水量变化见图1，随着干旱时间的延长，叶片相对含水量显著减小，对照组（CK）与处理2 d内无显著差异，当胁迫15 d时，叶片相对含水量最低，仅为25.83%。

2.2 干旱胁迫下白刺花叶片光合色素含量变化

光合色素是反映植物光合作用能力及营养作用的重要指标之一，表1为干旱胁迫下白刺花叶片光合色素Chla、Chlb、Car、Chl(a+b)、Chla/b、Chl/Car的变化，Chla、Chlb、Car、Chl(a+b)随干旱胁迫时间延长出现先增后降变化，Chla出现拐点的时间在10 d，而Chlb在8 d，Car在6 d，Chla/b和Chl/Car出现增-减-增变化。

2.3 干旱胁迫对白刺花叶片抗氧化保护酶系的影响

从图2A可以看出，随着干旱时间延长，白刺花叶片SOD活性呈先升后降趋势，处理2~8 d内，与CK比较，具有显著性差异，其中8 d时SOD活性最高，达458.85 U/g，比对照增加142.53%；之后10~15 d缓慢下降，比对照分别增加107.49%、66.55%、53.72%。

图2 干旱胁迫下白刺花叶片相关生理指标变化Fig. 2 Changes of related physiological indexes of S. davidii leaves in different drought stress period

从图2B可以看出，随着干旱时间延长，白刺花叶片POD活性变化与SOD活性变化相似，均呈先升后降的变化趋势，2~8 d内具有显著性差异，8 d时POD活性最高，达5.30 U/g，比对照增加68.25%；10~15 d缓慢下降。

从图2C可以看出，随着干旱时间延长，白刺花叶片CAT活性变化与POD活性、SOD活性变化相似，均呈先升后降的变化趋势，各处理间具有显著性差异，但其拐点出现在12 d，其活性高达105.29 U/g，比对照增加733.65%。

3种保护酶防御系统均表现先升后降的变化趋势，它们协同清除体内产生的氧自由基，减少逆境伤害，提高对环境的适应能力。SOD和POD活性拐点出现在8 d，而CAT稍滞后，在12 d出现拐点，且CAT活性变化比SOD和POD活性起伏大，推测3种保护酶防御系统协同作用，维持活性氧在相对低的变化范围，以维持细胞膜的完整性。

2.4 干旱胁迫对白刺花叶片膜伤害程度的影响

从图2D可以看出，随着干旱时间延长，白刺花叶片MDA含量具有显著差异。随着干旱胁迫程度的增强，MDA含量呈缓慢上升的趋势，15 d时达到高峰，峰值为6.20 mmol/g，比对照增加108.75%。

2.5 干旱胁迫对白刺花叶片渗透调节的影响

Pro是植物渗透调节物质之一，对原生质具有保护与保水作用，干旱胁迫时能够防止细胞体内水分散失。如图2E所示，Pro含量的变化呈先增后降的变化趋势，胁迫初期上升缓慢，胁迫中期变化明显。与CK相比，2~12 d具有显著差异，10 d出现峰值，高达459.67 mg/g，比对照增加226.45%，之后缓慢下降。

2.6 低温胁迫下白刺花叶片光合色素含量变化

低温胁迫下白刺花叶片光合色素含量的变化与干旱胁迫不同（表2），随着低温处理时间的延长，Chla、Chlb和Chl(a+b)呈下降变化，Chla/b变化相反，呈上升趋势，而Car呈先升后降趋势。反映了低温胁迫会降低植物的光合作用。

表2 低温胁迫下白刺花叶片光合色素含量变化Tab. 2 Changes of photosynthetic pigment content of S. davidii leaves in different cold stress period mg/g

2.7 低温胁迫对白刺花叶片抗氧化保护酶系的影响

从图3A可以看出，随着低温胁迫时间延长，白刺花叶片SOD活性呈先升后降趋势，各处理间具有显著性差异，其中10 d时，SOD活性最高，达431.72 U/g。与干旱胁迫相比较，胁迫初期至中期（2~10 d）SOD活性上升较快，说明经干旱处理后再经低温胁迫，短期内能够积累较多的SOD，反映出对低温较高耐性。

图3 低温胁迫对白刺花叶片相关生理指标变化Fig. 3 Changes of related physiological indexes of S. davidii leaves in different cold stress period

从图3B可以看出，随着低温胁迫时间的延长，白刺花叶片POD活性变化与SOD活性的变化相似，均呈先升后降的变化趋势，除10~20 d无显著差异外，其余时间下均具有显著性差异，20 d时，POD活性最高，达5.70 U/g，与干旱胁迫相比较，胁迫初期（2~5 d）POD活性上升相对较快。

从图3C可以看出，随着低温胁迫时间延长，白刺花叶片CAT活性变化与POD活性、SOD活性的变化相似，均呈先升后降的变化趋势，各处理间具有显著性差异，但其拐点出现在20 d，其活性高达129.4.29 U/g。与干旱胁迫相比较，胁迫初期变化较慢，10 d以后，积累较多。

低温胁迫下3种保护酶防御系统变化与干旱胁迫相似，均表现先升后降变化，从胁迫初期中看出，低温胁迫下SOD、POD和CAT活性物质的上升比干旱胁迫快，说明适当干旱胁迫能够提高白刺花的耐寒性。

2.8 低温胁迫对白刺花叶片膜伤害程度的影响

MDA含量的高低可直接反映逆境胁迫下细胞膜过氧化的程度，由图3D可以看出，随着低温胁迫时间延长，MDA含量呈缓慢上升的趋势，且各胁迫时间下白刺花叶片MDA含量差异显著，30 d达到顶峰，为7.01 mmol/g，比对照增加了126.13%。

2.9 低温胁迫对白刺花叶片渗透调节的影响

Pro为重要的渗透调节物质，可以调节细胞渗透势和冰点，提高植物抗寒性。如图3E所示，不同处理时间内Pro含量的变化呈上升趋势，各处理时间内Pro含量具有显著性差异。胁迫初期上升缓慢，胁迫中期至后期变化显著。与对照相比，30 d时，增加了208.40%。

3 讨论

植物在干旱胁迫时，外部叶片最初明显表现失水萎蔫，相对含水量降低。白刺花实生苗生长90 d进行自然断水后，处理早期无明显变化，后期基部叶片脱落或变黄，叶尖下垂，叶片卷曲，复水2 d后能恢复生长，表现出较强的抗旱性。高温干旱与低温冷害往往相伴存在，白刺花成熟植株为落叶灌木，而幼苗期冬季不落叶，为常绿植株，其叶片结构及代谢生理对冬季低温的适应能力必发生较大变化以维持细胞稳态来支持正常的生长发育。抗氧化酶系在植物逆境下其防御氧化胁迫伤害方面则发挥着重要作用，为适应环境避免自身伤害，植物主动或被动调动抗氧化酶系（SOD、POD、CAT）或非抗氧化酶系，它们之间以互相协调的作用方式共同清除活性氧和氧自由基，降低膜质过氧化产生的MDA，减缓其伤害从而提高抗耐性[6]。在抗氧化酶中，SOD主要是把O2.-转换成H2O2和O2，然后H2O2被POD和CAT清除[26]。因此，多数研究认为，干旱胁迫初期，SOD、POD、CAT一般呈上升趋势，随着胁迫增强，超出其忍耐范围，则会下降[6-10]。本研究也得出相一致的结论，干旱胁迫下白刺花幼苗叶片SOD、POD、CAT呈先升后降变化，SOD和POD干旱胁迫8 d时达到458.85 U/g和5.30 U/g峰值，而后开始下降；而CAT在胁迫初期（2 d时）与对照比较，无显著差异，呈缓慢上升变化，12 d出现峰值，之后下降，3种酶出现高峰时间有差异，这说明3种酶对不同干旱胁迫时期的敏感性不同，同时也反映出其在清除活性氧的作用途径及功能上具有差异性，但它们之间为相互协调的作用方式[27]。干旱处理可诱导植物幼苗对低温的抗性已有诸多报道，梁小红等[28]对多年生黑麦草的干旱-低温交叉适应研究得出，中度干旱后可使低温下的叶片相对含水量、叶绿素含量降幅减小，而脯氨酸和抗氧化酶活性增加。徐义群等[29]对茶树的研究中也得出，经PEG-6000预处理的茶苗低温胁迫下，叶片中抗氧化酶活性、渗透物质积累明显增加。本研究中，干旱胁迫后再进行低温处理，白刺花叶片SOD、POD、CAT三种抗氧化酶与干旱胁迫时变化相似，均表现先升后降。与干旱胁迫相比较，胁迫初期至中期（2~10 d）SOD活性上升较快，10 d达到高峰。POD活性胁迫初期（2~5 d）上升相对较快，20 d高达5.70 U/g，CAT胁迫初期变化较慢，10 d以后明显上升，20 d其活性高达129.4.29 U/g。

MDA是膜脂过氧化的终产物，含量的高低反映出细胞膜脂过氧化作用强弱和膜脂受破坏的程度。本研究中，随着干旱胁迫增强，MDA含量缓慢上升，15 d达到高峰，为6.20 mmol/g，比对照增加108.75%。干旱-低温胁迫下，胁迫初期（2 d内），与对照比较无明显差异，随着胁迫时间增长，MDA含量缓慢上升，30 d达到顶峰，为7.01 mmol/g，比对照增加126.13%。表明在长时间胁迫下，植物的抗氧化酶系统保护能力减弱，加重细胞的膜脂过氧化程度，致使MDA含量增加。

植物受逆境胁迫时，除了保护酶系统作为清除氧自由基和活性氧为保护屏障外，植物体内也会主动积累一些渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖等来提高对细胞的保水和持水能力以对生物膜起保护作用[30]。本研究中，干旱胁迫下，Pro含量呈先增后降趋势，胁迫初期上升缓慢，胁迫中期变化明显，10 d达到高峰，为459.67 mg/g，之后缓慢下降。干旱-低温胁迫下，各处理时间内具有显著差异，呈上升趋势，30 d达到538.5 mg/g，表明白刺花通过积累脯氨酸提高细胞的渗透调节能力，提高抗寒性，这与其他许多研究结果一致[21,28]。但脯氨酸在植物抗旱、耐寒性中的作用还存在争议，在对拟南芥[31]、大丽花[32]等证实脯氨酸与植物的抗性能力成正比，而李燕等[33]对皂角干旱胁迫研究和WANNER等[34]对拟南芥抗冷性研究发现，脯氨酸含量的升高对抗性的提高没有直接作用，可能是代谢上的被动表现或生理机能紊乱，而非适应性反应。因此，脯氨酸作为抗旱生理指标的调控机理仍需进一步求证。