丝瓜POD基因家族鉴定及盐胁迫下表达分析

骆彩霞，张 涵,，刘樟扬，赵钢军，喻 敏，刘敏敏**，吴海滨,3**

1. 佛山科学技术学院，广东佛山 528225；2. 广东省蔬菜新技术研究重点实验室/广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州 510640；3. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东广州 510000

丝瓜为葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（Luffaspp.）一年生攀援性草本植物，共有9个种，栽培种为有棱丝瓜（L. acutangulaRoxb.）和普通丝瓜（Luffa. cylindricaRoem.）[1]。丝瓜果实富含赖氨酸、苯丙氨酸等人体必需氨基酸、维生素B1/B2/C等抗氧化物质，是一种重要的药食兼用的多功能蔬菜[2-3]。

植物受到如高温、干旱、盐渍、寒冷等非生物胁迫或者病、虫、机械损伤等生物胁迫时，细胞代谢平衡被破坏，导致植物体内活性氧（reactive oxygen species, ROS）累积造成氧化胁迫（oxidative stress），使膜损伤、蛋白质变性、脂质过氧化、DNA损伤等，严重损害生物系统的稳定性[4-5]。植物细胞通过酶促活性氧清除系统和非酶活性氧清除系统清除或者降低ROS含量[5-6]。过氧化物酶（peroxidase, POD）可以还原植物细胞体内的ROS，生成H2O和O2，是植物酶促活性氧清除系统重要的组成部分[7-9]。

在多个物种中已经鉴定出POD家族成员，包括拟南芥[10]，水稻[11]、大豆[12]、茶树[13-14]、苹果[15]等。研究发现，拟南芥过氧化物酶RCI3受冷胁迫诱导，正调节拟南芥耐渗透胁迫和盐胁迫[16]。大豆中23个POD家族基因在耐旱系和干旱敏感系间显著差异表达，其中GsPOD40通过增强干旱胁迫下大豆的光合作用和抗氧化酶活性，从而减轻ROS诱导的氧化损伤，增强大豆的耐旱性[12]。苹果中，大部分POD基因受ABA、PEG、NaCl胁迫诱导表达，其中超表达MdPOD15，可缓解非生物胁迫对苹果愈伤组织的损伤[15]。朱海生等[17]利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法扩增了1个丝瓜POD基因，并表示其可能与丝瓜果肉褐化有关。

然而，到目前为止，从基因组层面鉴定丝瓜POD家族基因，及其对盐胁迫响应研究鲜有报道。本研究利用生物信息学方法鉴定丝瓜POD家族成员，并对其基因结构、理化性质、系统进化、顺式作用元件及其在盐胁迫下表达模式分析，为探究POD基因家族调控丝瓜盐胁迫时的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试丝瓜品种为广东省农业科学院蔬菜研究所培育的高代自交系S1174。

1.2 方法

1.2.1 丝瓜POD家族成员鉴定 从Pfam（http://pfam.xfam.org/）下载POD家族的保守结构域PF00141，利用TBtools[18]检索本课题组装的有棱丝瓜基因组（未发表）的蛋白序列，得到丝瓜POD家族成员的候选序列。为保证候选序列的准确性，在NCBI-CDD数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）手动检索，去除不含有POD家族保守域的序列。利用ProtProm（http://web.expasy.org/protparam/）网站预测POD家族成员的分子量、等电点和亲水性等理化性质。

1.2.2 POD家族成员染色体定位、系统进化、基序、基因结构、启动子顺式作用元件分析 使用在线软件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）进行染色体定位可视化分析。利用MEGA 7.0软件的邻接法构建丝瓜和拟南芥POD蛋白的系统进化树（Bootstrap=1000）。利用TBtools软件[18]进行染色体共线性分析。利用在线软件MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）进行氨基酸序列基序分析。使用在线软件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析丝瓜POD家族成员的基因结构。使用在线软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）进行基因启动子的顺式元件分析。

1.2.3 NaCl处理 挑选饱满种子，催芽后，将露白种子播种于光照培养箱，培养2周后，分别进行200、500 mmol/L NaCl胁迫处理，对照加等量清水，每个处理8株，3个生物学重复。胁迫处理7 d后，取叶片，快速用ddH2O清洗2遍，液氮速冻，存入超低温冰箱备用。

1.2.4 POD活性测定 利用POD活性测定试剂盒（索莱宝，北京）测定丝瓜叶片POD活性。主要步骤如下：称取液氮研磨的粉末样品0.1 g，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，离心取上清。于EP管中按次序分别加入试剂一120 μL、试剂二30 μL、试剂三30 μL、蒸馏水60 μL、样本5 μL，立即混匀并计时，取200 μL于酶标板中，记录470 nm下30 s时的吸光值A1和1 min 30 s时的吸光值A2，计算△A=A2-A1。计算POD活性：POD（U/g）=9800×△A/W，W：样品质量。

1.2.5 RNA提取及表达分析 使用Primer Premier 5在基因非保守区域设计特异性引物。使用RNA提取试剂盒（全式金，北京）提取样品的总RNA，使用TransScript®II Green Two-Step qRT-PCR SuperMix（全式金，北京）反转录成cDNA，并进行qPCR扩增。反应体系20 μL：2 μL cDNA，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，10 μL 2×prefectStart Green qPCR SuperMix，7.2 μL ddH2O。反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环40次；3次技术重复。采用2-ΔΔCT方法计算基因的表达量。对差异表达基因在OmicShare平台（https://www.omicshare.com/tools/）进行表达趋势分析，设定模块数量为20，P为0.01，获得显著性和非显著性基因表达模式。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0软件对数据进行整理、统计分析。

2 结果与分析

2.1 丝瓜POD基因家族成员鉴定及其蛋白的理化性质分析

通过TBtools比对筛选，结合CDD工具检测保守结构域，最终从丝瓜中鉴定出94个POD家族基因。最长的POD蛋白（Lac05g017090）含有688个氨基酸残基，最短的（Lac05g003440）含有89个氨基酸残基，平均为309个；分子质量最大为75 617.64（Lac05g017090），最小为10 276.5（Lac 05g003440）；理论等电点（pI）介于4.58（Lac02g 012390）~10.34（Lac00g002910）之间。其中pI>7的POD蛋白有57个，达60.64%，表明丝瓜POD蛋白家族大部分富含碱性氨基酸；其中82个蛋白具有亲水性，12个蛋白不具有亲水性（表1）。94个POD家族成员不均匀地分布在丝瓜13条染色体，其中，7号染色体分布的最多，为20个；12号最少，为1个（图1）。

图1 丝瓜4、7、12号染色体上的POD家族成员Fig. 1 POD family members on chromosome 4, 7 and 12

表1 丝瓜POD基因家族成员信息Tab. 1 The POD gene family identified from luffa genome

2.2 POD家族成员进化分析

利用MEGA 7软件对94个丝瓜POD家族成员和73个拟南芥POD家族成员的氨基序列构建系统进化树（图2）。2个物种的POD家族成员分成了3个类群Group I、Group Ⅱ、Group Ⅲ，其中Group I只有1个POD蛋白家族成员（Lac10g 028260），Group Ⅲ成员最多，包含6个亚组，共161个成员。Group Ⅲ-A全部为拟南芥家族成员，Group Ⅲ-F的成员最多（45个），包括30个丝瓜、15个拟南芥POD家族成员。

图2 丝瓜和拟南芥POD家族成员进化分析Fig. 2 Evolution analysis of POD family members in Luffa and Arabidopsis

丝瓜和拟南芥的POD家族基因之间的共线性分析结果显示（图3），2个物种之间有12对共线性基因，丝瓜中有33个POD家族基因与拟南芥的37个POD家族基因存在共线性关系。其中，AT1G24110基因在丝瓜中有4个共线性基因Lac03g015670、Lac06g003720、Lac09g002650、Lac09g018070。而AT1G05240、AT1G30870、AT2G 18140、AT2G37130、AT3G21770、AT3G50990、AT4G35000、AT4G36430、AT5G58390、AT5G66390在丝瓜中分别有2个共线性基因。Lac04g020260和Lac11g009150基因在拟南芥中分别有4个共线性基因AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G 66390和AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G66390。以上结果表明丝瓜中POD家族基因发生了扩张。

图3 丝瓜和拟南芥POD家族成员共线性分析Fig. 3 Collinearity analysis of orthologous POD gene pairs between Luffa and Arabidopsis

2.3 丝瓜POD家族基因结构、蛋白保守结构域和保守基序分析

利用GSDS在线软件对POD家族成员的基因结构进行分析。结果表明，POD基因家族具有相似的基因结构，外显子数量介于1~14个之间，大多数含有3个或者4个外显子。

蛋白保守结构域分析表明，丝瓜POD家族成员都含有plant peroxidases保守结构域，其中Lac01g005270和Lac05g017090含有2个plant peroxidases保守结构域（图4）。保守基序分析表明，不同的丝瓜POD家族成员含有的基序数量不同，其中Lac09g020210只含有1个基序，Lac01g005270和Lac05g017090含有20个基序（图5）。

图4 丝瓜POD家族成员保守结构域分析Fig. 4 Analysis of conserved domains of POD family members in Luffa

图5 丝瓜POD家族成员保守基序分析Fig. 5 Analysis of motifs of POD family members in Luffa

2.4 丝瓜POD家族成员的顺式作用元件分析

对丝瓜POD家族成员启动子序列顺式作用元件分析发现，POD基因普遍存在与植物激素响应和胁迫响应相关的顺式元件（图6）。植物激素响应元件包括脱落酸响应元件（ABRE，236个），生长素响应元件（AuxRE，66个），赤霉素响应元件（GARE，82个），乙烯响应元件（ERE，154个），水杨酸响应元件（SARE，45个），茉莉酸甲酯响应元件（MeJRE，264个）。胁迫响应元件包括低温响应元件（LTR，53个），低氧胁迫响应元件（ARE，264个），光响应元件（LRE，1054个），干旱响应元件（104个）包括参与干旱诱导的MYB结合位点（MBS）和脱水反应元件（DRE），防御和胁迫响应元件（DSRE，56个）。

图6 丝瓜POD家族成员启动子顺式元件分析Fig. 6 Analysis of cis-elements in promoters of POD family members in Luffa

2.5 盐胁迫处理后丝瓜叶片POD活性升高

为了研究POD在丝瓜幼苗受盐胁迫时的作用，本研究测定了盐胁迫后丝瓜叶片中POD活性的变化。结果表明，在受到盐胁迫后，丝瓜叶片中POD活性升高，随着盐处理浓度的增加，POD活性增加，达到极显著水平（图7）。

图7 盐胁迫后丝瓜叶片POD活性Fig. 7 POD activity of Luffa leaves after salt stress

2.6 丝瓜POD家族成员盐胁迫表达分析

采用qRT-PCR技术对丝瓜POD家族成员在不同浓度盐胁迫下的表达进行分析。结果表明，在200、500 mmol/L NaCl溶液处理下，56个基因受NaCl胁迫诱导表达，包括6个基因（Lac07 g019770、Lac08g017630、Lac08g017630、Lac09g 021570、Lac10g006770、Lac11g002020）在200、500 mmol/L胁迫处理下极度上调表达（>100倍），另外有14个基因在丝瓜叶片中不表达（图8）。对80个检测到的基因进行表达趋势分析，获得8种基因表达趋势模式，有2种显著的基因表达趋势模式（P<0.01）（图9）。其中profile7模式中，17个基因在200、500 mmol/L胁迫处理下表达量依次升高，profile6模式中，18个基因受盐胁迫后表达量升高，且在200、500 mmol/L胁迫处理下表达量相似（图9）。另外，11个基因只在500 mmol/L胁迫处理时表达量上升（profile4），10个基因只在200 mmol/L胁迫处理下表达量上升（profile5），8个基因在200 mmol/L胁迫处理下无变化，而在500 mmol/L胁迫处理下表达量下降（profile3）。

图8 丝瓜POD家族成员盐胁迫表达分析Fig. 8 Gene expression levels of POD family members after salt stress in Luffa

3 讨论

POD是一种对环境条件十分敏感的氧化酶类，其主要作用是清除氧代谢中产生的活性氧，是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一[8-9]。植物在受到逆境胁迫时，导致ROS累积，随后过氧化物酶活性升高，增强植物清除活性氧的能力，降低ROS对细胞功能的伤害[5,19]。油棕幼苗经过缓慢低温胁迫可以提高POD活性，进而提高油棕幼苗抗寒性[20]。在抗病木薯种质受到细菌性萎蔫病侵染后，POD活性显著高于感病品种，POD与多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性可作为木薯抗病性鉴定的辅助指标[21]。本研究中，丝瓜受到盐胁迫后，POD活性增强，并且随NaCl浓度升高而活性增强，其可能参与丝瓜盐胁迫下活性氧的清除，降低活性氧对细胞的伤害，增强丝瓜对盐胁迫的抵抗能力。本研究进一步从丝瓜基因组层面，鉴定到94个POD家族成员，全面分析了POD家族成员的理化性质、系统发育、染色体定位、基因共线性、基因结构、顺式元件，以及对NaCl胁迫的响应，为进一步研究POD家族成员生物功能奠定基础。

理化性质分析表明，丝瓜POD家族成员大部分为亲水性蛋白（82/94）；一半富含酸性氨基酸，一半富含碱性氨基酸，这与茶树[13]、石榴[22]、大豆[12]研究相似。基因结构和保守基序分析发现，所有的丝瓜POD家族成员都含有典型的过氧化物酶结构域，以及大部分成员含有全部的10个基序（66/94），推测其可能在维持细胞内ROS平衡起功能，不同的蛋白基序可能决定了其参与不同的调控途径，执行不同的生物学功能[23-24]。

基因复制是基因组进化和功能分化的关键动力之一[25]。在进化历史过程中，大多数高等植物都经历了多倍体化，是植物提高环境适应性的普遍现象[26]。在棉花[27]、二穗短柄草[28]、葡萄[23]中POD家族基因进化过程中，发生基因串联重复或者片段重复，是POD家族基因演化的主要驱动力之一。本研究中，在丝瓜7号染色体上有连续16个POD家族基因，5号染色体上有连续7个POD家族基因，表明POD家族基因在丝瓜中存在物种特异性扩张。基因共线性分析表明丝瓜和拟南芥物种之间存在12对共线性基因，其中部分拟南芥POD基因在丝瓜中存在多个同源基因，表明丝瓜POD家族存在串联重复基因或者片段重复基因。

许多研究表明，植物过氧化物酶参与植物生长和发育过程中的各种细胞过程，以及植物对非生物和生物胁迫的响应。玉米中根中的膜结合过氧化物酶（pmPOX1、pmPOX2a、pmPOX2b和pmPOX3）受茉莉酸甲酯、水杨酸和病原体诱导表达[29]。葡萄中，30个POD基因受NaCl、drought、和ABA诱导表达[29]。苹果中，超过94.1%（48/51）POD基因受ABA、PEG、NaCl胁迫诱导表达[15]，谷子中POD家族成员受干旱和ABA诱导表达[30]。通过对基因启动子顺式作用元件分析表明，丝瓜POD家族成员启动子含有大量的与激素诱导、非生物胁迫相关的顺式作用元件，表明其可能受非生物胁迫诱导表达。对丝瓜POD家族成员盐胁迫后基因表达分析发现，56个基因受盐胁迫诱导表达，其中6个基因极度上调表达（>100倍），可能这些基因参与丝瓜受到盐胁迫后的过氧化物酶的合成，进而参与细胞ROS的清除。

综上所述，本研究首次从丝瓜基因组鉴定出94个丝瓜POD家族成员，并对其进行理化性质、基因结构、基因定位、基因共线性分析以及盐胁迫响应分析。其中56个POD基因受盐胁迫诱导表达，其可能参与丝瓜对盐胁迫响应。本研究为更深入研究丝瓜POD基因家族的生物学功能奠定基础。