鸡源IL-21 基因的密码子优化、表达及生物活性分析初探

朱爱臣，朱凯晴，孙 鹏，张建楼，李 妍，霍书英

（河北农业大学 动物医学院/河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001）

白细胞介素（Interleukin，IL）简称白介素，是20 世纪80 年代以来发现的一类细胞因子。白细胞介素21（IL-21）是一种Ⅰ型细胞因子，由4 个α 螺旋束组成，主要由自然杀伤性T 细胞（NKT）、滤泡辅助性T 细胞和Th17 细胞产生，作为Th17 细胞的自分泌生长因子发挥作用，并在自身免疫性疾病中发挥关键作用［1］。例如，通过促进Tfh 和Th17细胞的增殖和发育，平衡辅助T 细胞亚群，诱导B细胞生成和分化为浆细胞，以及增强免疫球蛋白的产生［2］。

IL-21 具有增强或抑制免疫的功能，它不仅在抗肿瘤和抗病毒反应中起着关键作用，而且对促进自身免疫疾病和炎症性疾病发展的炎症反应发挥着重要作用［1］。许多人类免疫介导的疾病，如炎症性肠病［3］、银屑病［4］、系统性红斑狼疮［5］和类风湿关节炎［6］，IL-21 均表现出不同程度的分泌增强。有研究表明，给小鼠注射外源性IL-21 可增强其自身免疫［7］。还有研究表明IL-21 可以通过诱导IL-10 来调节免疫反应，揭示了这种细胞因子的免疫抑制作用［8］。为探究鸡IL-21 的生物功能，本研究扩增了IL-21 基因并利用人和鸡偏爱的密码子对其进行密码子优化，首次通过真核表达系统实现了基因的高效表达；MTT法检测了纯化后的重组蛋白IL-21 的淋巴细胞增殖功能；利用生物信息学软件分析了鸡IL-21 基因序列以及其编码氨基酸序列的结构特征，为进一步研究鸡IL-21 生物学功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

真核表达载体pcDNA3.1A 由本实验室保存；DH5α 购自北京全式金生物技术有限公司；人胚胎肾细胞（HEK）293T 为实验室保存细胞系；京红1 号蛋鸡购于河北大午农牧集团有限公司；Trizol、Lipo-fectamine 3000 试剂购于Thermo Scientific（ 美国）；His Tag Monoclonal Antibody 购于Cell Signaling Technology（美国）；Goat Anti-Mouse IgG H&L/AP 购于Bioss（北京）；BCIP /NBT 底物显色试剂盒购于Solarbio（北京）； DL2000 DNA Marker、Blue Plus®Protein Marker 购于TransGen BIotech（北京）；DMEM培养基、胎牛血清购于Gibco（美国）；MTT 购于Sigma（ 德国）；His-Tagged Protein Purification Kit、BCA Protein Assay Kit 购于CWBIO（北京）。

1.2 生物信息学分析

利用ExPASy 服务器上的ProtParam 工具预测IL-21 蛋白分子质量的预测，使用SignalP-6.0 和TMHMM-2.0 在线软件对IL-21 蛋白进行信号肽和跨膜区域预测，应用NetNGlyc-1.0 和NetPhos-3.1 在线软件对IL-21 蛋白进行糖基化位点和磷酸化位点预测。

1.3 IL-21 基因的克隆、真核表达载体构建及鉴定

根据GenBank 鸡IL-21 基因的全长序列（NM_001024835.1），通过Primer 5.0 软件在开放阅读框（ORF）两端设计1 对引物，在上游引物中引入酶切位点Hind Ⅲ；在下游引物中引入酶切位点BamHⅠ，以便于将克隆的IL-21 基因与载体连接。IL-21 wt（wild type，wt）-F：5′-CCCAAGCTT（Hind Ⅲ）ATGGAGAGGATGATTATTTTC-3′；IL-21wt-R：5′-CGCGGATCC（BamHⅠ）TCAAATAGTAGATTTTCCGTAG-3′。首先从新鲜的鸡脾脏提取淋巴细胞，通过Trizol 法提取总RNA，并反转录成cDNA，以cDNA 为模板扩增IL-21 基因。将PCR 产物和pcDNA3.1A 载体分别通过Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切，将酶切后回收的基因片段和载体片段通过T4 DNA 连接酶进行连接，获得pcDNA-IL-21wt/MH 重组质粒。

1.4 IL-21 密码子优化、表达载体构建

根据人和鸡偏爱的密码子对鸡IL-21 进行密码子优化改造，优化后的基因序列用primer 5.0 软件设计引物，并在上游引物引入酶切位点XhoⅠ；在下游引物引入酶切位点SfuⅠ。上游引物为：IL-21opt（Optimized，opt）-F：5′-3′CCCGCTCGAG（XhoⅠ）ACACCATGGAAAGAATGATTATTTTTTGC，下游引物为：IL-21opt-R：5′-3′GGGTTT TTCGAA（SfuⅠ）AATTGTAGATTTTCCATATCTTTC 将引物序列和优化后的基因序列共同送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成，连接至pUC-57 载体。命名为pUC-57-IL-21opt。以合成后载体为模板进行扩增，反应条件同上，扩增后的产物经过XhoⅠ和SfuⅠ双酶切连接至真核表达载体pcDNA3.1A 上，连接方法同上，连接完成后并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。获得pcDNA-IL-21opt/MH 重组质粒。

1.5 HEK293T 细胞的转染、重组蛋白的表达及纯化

采用Lipo-fectamine 3000 实现IL-21 基因在HEK293T 细胞的瞬时表达。将pcDNA-IL-21wt/MH、pcDNA-IL-21opt/MH 和pcNDA3.1A 空载体分别转染细胞。转染48 h 后分别收集表达培养基和转染细胞。 Western blot 检测表达培养基和裂解液上清（同时设pcDNA-3.1A 作为阴性对照），用ImageJ 软件分析野生型和优化型的表达量。将样品缓慢的通过含有Ni-NTA 琼脂糖填料的重力柱上，用洗脱缓冲溶液（300 mmol/L 咪唑，pH8.0），洗脱目的蛋白，收集洗脱液，Western-blot 检测纯化后的蛋白。

1.6 重组蛋白对脾脏淋巴细胞增殖的影响

鸡脾脏淋巴细胞分离实验参照文献［9］进行，取SPF 鸡新鲜脾脏（摘取2 h 之内），利用淋巴分离液分离脾脏淋巴细胞，分离的淋巴细胞用含10%FBS，1%双抗的RPMI-1640 培养基悬浮，以浓度为1×106cells/mL 接种于96 孔板中（每孔50 μL 悬浮液），对照组加入BSA（15 mg/L），IL-21 分别设为0、1、5、10、15、20 mg/L，每组设置3 个复孔，37 ℃，5% CO2中继续培养72 h。培养后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），加入100 μL DMSO 溶解紫黑色结晶，在2 h 内测量OD490nm值。淋巴细胞增殖能力用淋巴细胞增值指数SI（Stimuate index）来表示，SI=实验组OD490nm值/对照组OD490nm值。

1.7 数据分析

使用GraphPad Prism 8 软件对实验数据进行One-way ANOVA 分析实验组的差异性，****表示有统计学差异显著，P值为＜0.000 1，ns表示统计学上差异不显著，P值为＞0.05，数据按“x±s”表示。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

2.1.1 IL-21 基因序列及其编码蛋白分子质量的预测 Genbank 预测鸡IL-21 的序列长度为438 bp，编码145 个氨基酸，计算分析IL-21 蛋白分子质量约为17 ku。

2.1.2 IL-21 蛋白跨膜区和信号肽预测 经TMHMM-2.0 在线软件对IL-21 进行跨膜区域分析，结果显示跨膜区域位于第4 ～22 个氨基酸之间（图1）。运用SignalIP-6.0 对IL-21 进行信号肽位点预测分析，显示信号肽切割位点位于19 和20 位氨基酸之间（图2），表明鸡IL-21 为跨膜分泌性蛋白。

图1 鸡IL-21 蛋白跨膜区预测Fig.1 Transmembrane domain prediction of IL-21 protein in chicken

图2 鸡IL-21 蛋白信号肽切割位点预测Fig.2 Signal peptide cleavage site prediction of IL-21 protein in chicken

2.1.3 IL-21 蛋白糖基化位点和磷酸化位点预测 对IL-21 的氨基酸序列进行磷酸化位点预测分析，结果显示共预测到19 个磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）10 个，苏氨酸（Thr）7 个，酪氨酸（Tyr）2 个（图3）。使用NetNGlyc-1.0 在线软件进行N-糖基化位点的预测，结果显示，鸡IL-21 氨基酸序列没有潜在的O 糖基化位点（图4），但是在第83 位天冬酰胺含有1 个潜在的N-糖基化位点。

图4 鸡IL-21 蛋白糖基化位点预测Fig.4 Glycosylation site prediction of IL-21 protein in chicken

2.2 鸡IL-21 基因克隆与鉴定

从鸡脾脏淋巴细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA 为模板，通过PCR 扩增IL-21 基因。琼脂糖凝胶电泳结果如图5A 可见，扩增的PCR 片段约为438 bp，符合预期片段大小。使用Hind Ⅲ和BamHⅠ将此DNA 片段插入pcDNA3.1A 载体上构建成pcDNA-IL-21wt（图5B）。酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序，结果显示，本试验扩增的IL-21序列与GenBank（NM_001024835.1）相比，有2 个碱基突变（141C →141T，312C →312T），但不影响编码的氨基酸序列（图5D）。重组载体经双酶切，切出预期大小为438 bp 的片段（图5C），表明构建的载体结构正确。

图5 PCR 产物鉴定、载体构建、酶切鉴定和核苷酸序列比对Fig.5 Identification of the PCR product, vector construction, enzyme digestion identification and nucleotide sequence alignment

2.3 鸡IL-21 基因的优化与鉴定

为了提高鸡IL-21 在HEK293T 细胞上的表达水平，根据人和鸡偏爱的密码子对IL-21 进行优化改造（图6C），并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成并连接至pUC-57 载体。经过对比，优化后的IL-21 相对于野生型IL-21 的核苷酸序列相似性为79.09%，优化后的序列与真核表达载体pcDNA3.1 连接并与Myc/His 标签相融合，命名为pcDNA-IL-21opt/MH（图6A）。重组载体经双酶切鉴定结果正确大小为438 bp（图6B）。酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序。

图6 载体构建、酶切鉴定和优化核苷酸序列比对Fig.6 Vector construction, enzyme digestion identification and nucleotide sequence alignment

2.4 鸡IL-21 蛋白在HEK293T 细胞表达的鉴定和纯化

通过Lipo-fectamine 3000 法将pcDNA-IL-21wt/MH 和pcDNA3.1A-IL-21opt/MH 转染至HEK293T细胞中（同时转染空载体pcDNA3.1A），Western blot 检测培养基上清和细胞裂解液上清，结果发现在大约26 ku 处有均有1 条特异性条带（图7A）。根据ImageJ 灰度值分析发现，优化后的IL-21 基因在细胞上清中的表达比野生型在细胞上清中的表达量高大约4.4 倍（P＜0.000 1）（表1，图7C），将鉴定后的蛋白经Ni-NTA 琼脂糖凝胶粒纯化，Western-blot 检测蛋白纯化后的效果（图7B）。

图7 HEK293T 细胞表达的鉴定和纯化Fig.7 Identification of HEK293T cell expression and purification

2.5 鸡IL-21 蛋白生物活性分析

为了鉴定纯化后的重组IL-21 蛋白是否有生物活性，通过淋巴细胞增殖实验（MTT 法）检测其对淋巴细胞的增殖效果。结果表明，随着重组IL-21蛋白浓度的增高，淋巴细胞增殖指数逐渐升高，表明IL-21 对鸡脾脏淋巴细胞增殖有明显的促进作用，纯化后的IL-21 蛋白有良好的生物活性（图8）。

图8 MTT 检测脾脏淋巴细胞的增殖Fig.8 The proliferation of splenic lymphocyte was detected by MTT

3 结论与讨论

IL-21 是2000 年由Parrish-Novak 等发现的一种多效性的新型免疫调节细胞因子［10］，自被发现以来，人们针对其来源和体内外生物学功能进行了广泛的研究。人们研究发现，IL-21 通过其受体IL-21R 发挥生物学功能。IL-21R 广泛表达免疫细胞（T 细胞、NK 细胞、B 细胞、DCs 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）和非免疫细胞（上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞），因此IL-21 具有广泛的生物学功能［11］。目前对人、猪和牛等的IL-21 研究较多，但是对鸡的IL-21 报道较少。

为了研究鸡IL-21，本研究根据GenBank 发布的鸡IL-21 预测序列，利用RT-PCR 从鸡脾脏淋巴细胞中克隆了IL-21cDNA，通过软件分析了鸡IL-21与其他物种的序列，构建真核表达载体，并首次成功在真核表达系统表达和制备了IL-21 重组蛋白。构建的真核表达载体pcDNA3.1A-IL-21/MH，与Genbank 中序列进行对比发现，第141 位核苷酸由C 突变为T，第312 位核苷酸由C 突变为T，但不影响氨基酸序列。Western blot 在培养基上清和细胞裂解液上清中在大约26 ku 处同时检测到特异性条带，经过优化密码子之后的IL-21 蛋白表达量显著上升（P＜0.000 1），表明构建的真核表达载体可介导IL-21 在真核细胞中分泌表达，这与预测IL-21基因含有信号肽结果一致，但是蛋白大小明显高于理论计算值17 ku，这可能是预测序列中含有1 个N-糖基化位点所引起的。为了检测表达的蛋白是否具有生物活性，本试验中利用Ni-NTA 琼脂糖凝胶纯化系统将表达的蛋白进行纯化，经MTT 法检测，发现纯化后的IL-21 蛋白能够促进鸡脾脏淋巴细胞体外的增殖，表明表达的蛋白具有良好的生物活性，这为进一步研究鸡IL-21 蛋白的功能奠定了一定的基础。

糖基化是常见的蛋白翻译后修饰，它可以改变蛋白质的构象，增加蛋白质的稳定性。有研究表明，在蛋白表达过程中，用糖基化抑制剂衣霉素去抑制蛋白糖基化，从而可以改变蛋白质的分子质量［12］。糖基化是一种将聚糖与蛋白质或脂质连接的酶过程。在真核生物中约有一半的糖蛋白是糖基化的，糖基化的变化可以调节炎症反应，使病毒免疫逃逸，促进癌细胞转移或调节细胞凋亡［13］。N-糖基化是最常见的蛋白质修饰类型之一，它在正常的生理过程中发挥着重要作用［14］，如宿主与病原体的相互作用、细胞分化、迁移、肿瘤侵袭和转移、细胞追踪和信号传递［15］。鸡的IL-21 含有1 个N-糖基化位点，鸡的IL-21 是否具有以上功能还有待进一步研究。

信号肽是蛋白质在N 端的一段短肽，一般由15 ～30 个氨基酸组成，主要携带蛋白质的分泌信息，具有平衡蛋白质的翻译速度和转运速度的功能［16-17］。本试验在培养基上清中检测到了蛋白的表达，这与生物信息学软件SignalIP-6.0 分析在IL-21 的第1 ～19 位氨基酸为其信号肽序列相一致。

真核表达系统表达出来的蛋白具有正确的蛋白质折叠和糖链修饰［19］，并且表达出来的蛋白通常具有良好的生物活性。不同于真核表达系统，原核表达系统具备成本较低、产量大，操作简便等优点，但是，真核基因在原核表达系统中往往因为错误的折叠而形成不可溶性的包涵体，没有生物活性，需要对包涵体进行复性，才可恢复蛋白质的生物活性，从而导致实验周期延长，增加操作难度。本试验通过真核表达系统表达鸡IL-21 蛋白，便于后期对其生物功能进行研究。