美国白蛾中肠受体蛋白HcABCC4 与Bt Cry9Ea10 结合特性分析

王晓洁，王 哲，赵 丹，王 倩，陆秀君,2，郭 巍

（1.河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001；2.河北省核桃工程技术研究中心，河北 临城 054300）

美国白蛾（Hyphantria cunea）是重要的检疫性农林害虫，在我国连续多年爆发成灾且危害范围逐年扩大［1］。目前，生产上防治美国白蛾采取化学防治和生物防治相结合的方法［2-3］，生物防治中源自苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的Bt Cry1Ac 毒素蛋白应用最广泛［3］，近年来对Bt Cry1Ab 也有较深入研究［4］。苏云金芽胞杆菌Bt Cry 蛋白与昆虫中肠上皮细胞膜上的特异性受体结合，导致中肠穿孔，是其杀虫的重要环节［5］。多种昆虫中肠蛋白已被鉴定为Bt Cry 毒蛋白的受体，主要包括：钙粘蛋白（Cadherin，CAD）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN）和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）等4 类［6］。

ABC 转运蛋白包含2 个结合膜及水解ATP 的腺苷酸结合结构域（Nucleotide-binding domains，NBD） 和2 个跨膜结构域（Trans-membrane domain，TMD），包括ABCA 至ABCG 等八类。该类蛋白不仅是Bt Cry 蛋白的受体，其跨膜结构域也参与农药对昆虫的毒力作用过程［5］。目前已在棉铃虫（Helicoverpa armigera）、美洲棉铃虫（H.zea）、 小菜蛾（Plutella xylostella）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和草地贪夜蛾（S.frugiperda）等至少14 种重要昆虫得到证实［7］。多种昆虫的ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCG1 等中肠蛋白分别能与Bt Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ca、Cry1Fa、Cry2Aa 和Cry2Ab 结合［6］。棉铃虫ABCC2、ABCC3 可以与Bt Cry1Ac 特异性结合［7］。小菜蛾ABCB1、ABCG1 和ABCC2 与Bt Cry1Ac 特异性结合［8］；甜菜夜蛾（S.exigua）ABCC2 与Bt Cry1Ac 和Cry1Ca 特异结合［9］；桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）ABCC 受体与Cry1Ah 和Vip3Aa19 对其杀虫协同增效有关［10］；斜纹夜蛾ABCC2 是Bt Cry1Ca 功能受体［6］。由此可见，ABCC 类受体是多种鳞翅目昆虫中广泛存在的Bt Cry 蛋白受体。目前，有关ABCC4 受体蛋白相关研究报道，仅见于家蚕中存在ABCC4基因［11］；经Bt Cry1Ac 处理后，家蚕（Bombyx mori）ABCC4基因表达上调（基因序列尚未公开）［11］。由此推测ABCC4 蛋白可能也是鳞翅目昆虫Bt Cry 毒素的重要受体蛋白，查阅GenBank 可知，目前共收录15种鳞翅目的ABCC4基因，但该类基因的功能仍不清楚，有待深入研究。

Bt Cry9 类蛋白是一类对多种鳞翅目害虫高效的毒素蛋白。有研究表明，Bt Cry9Aa 和Vip3Aa 对二化螟（Chilo suppressalis）具有协同增效作用［12］；Bt Cry9Aa3 对小菜蛾和亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis） 有较高的杀虫活性［13］；Bt Cry9Ee对Cry1Ab 抗性亚洲玉米螟致死率高达96%，可以作为理想的候选基因延缓和克服抗性［14］；cry2Ab+cry9Ea 复合基因型菌株JN001 对亚洲玉米螟表现出较高毒性［15］。有关Bt Cry9 类蛋白对美国白蛾的杀虫活性，初步研究表明Cry9Ea10 对美国白蛾有杀虫活性［16］。

为明确Bt Cry 蛋白对美国白蛾的生防潜力及作用机制，基于中肠iTraq 和转录组数据分析，前期本实验室已发现美国白蛾中肠中存在APN、CAD、ALP，ABC 等多种Bt Cry 毒素的受体蛋白［17-18］，包括ABCB6，ABCC4 和ABCG4 等多个ABC 类蛋白，鉴定得到美国白蛾中肠受体蛋白基因HcABCC4（GenBank 登录号为MW727508.1），其全长为4 161 bp，并克隆表达了其约70 kD 的TMD 结构域（待发表）。Bt Cry9Ea10 蛋白是本实验室前期构建的对鳞翅目多种害虫高效的蛋白［16］。为明确美国白蛾受体蛋白ABCC4 与Bt Cry9Ea10 毒蛋白的互作机制，本研究在生物测定基础上，开展了Cry9Ea10毒素蛋白与HcABCC4TMD 结构域蛋白的体外结合试验，利用RNAi 技术结合生物测定研究HcABCC4基因沉默后Cry9Ea10 蛋白对美国白蛾毒力变化，以明确Bt Cry9Ea10 蛋白对美国白蛾的作用机制，为进一步开发害虫防治新靶标提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

美国白蛾虫卵购自中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所昆虫病毒研发中心，置于（26±1）℃，RH(60±5)%，光周期16L∶8D 培养箱中孵化，1 龄幼虫后饲喂人工饲料，至四龄幼虫，备用。人工饲料的配制参考曹利军等［19］方法。

配体印记试验预染Protein Marker 购自Thermo公司；蛋白抗体为实验室保存；Anti 6 × His 抗体购自中杉金桥公司，羊抗鼠IgG-AP 抗体、羊抗兔IgG-AP 抗体购自BOSTER 公司。

1.2 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白对美国白蛾的杀虫活性测定

Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白对美国白蛾四龄幼虫生物测定参考赵丹方法［20］。将Bt Cry 蛋白逐级稀释至终浓度为28.0、56.0、112.0、224.0 和448.0 μg/mL，以无菌水为对照；逐日统计幼虫死亡情况，3 d 后，计算平均校正死亡率（%），SPSS 26.0 推断毒力回归方程，得到LC50和LC70。

1.3 美国白蛾HcABCC4 蛋白系统发育树构建

利用本实验室前期克隆的HcABCC4 基因（GenBank 登录号：MW727508.1）推导的氨基酸序列，与GenBank 数据库检索到的鳞翅目昆虫ABCC4 氨基酸序列，采用MEGA7.0 软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ），构建其系统发育树。

1.4 HcABCC4 TMD 重组蛋白与Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白Ligand blot 分析

利用本实验室前期构建的HcABCC4 TMD 结构域（第25 ～1 387 bp 区）表达载体，表达70 kD重组蛋白，10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜，将PVDF 膜用1%BSA 室温封闭1 h，与2 μg 的Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 毒素蛋白孵育1 h， 与Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 抗体（前期实验室制备）稀释10 000 倍条件下进行配体印记实验，以未进行Bt Cry 毒素孵育的处理作为对照，分析HcABCC4 TMD 蛋白与Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 毒素蛋白的结合特性。

1.5 HcABCC4 TMD 重组蛋白与2 种BtCry 蛋白亲和力测定

以酶联免疫吸附法（ELISA）分别测定Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 蛋白与HcABCC4 TMD 蛋白的结合能力。将终浓度5 μg/mL HcABCC4 TMD 受体蛋白，加入酶标板4 ℃包被过夜。各孔中分别加入0、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 蛋白，孵育1 h；漂洗，分别加入一抗（Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 特异抗体），二抗（AP 偶联的羊抗兔IgG），100 μL含1 mg/mL 对硝基苯磷酸二钠六水合物（pNPP）显色液显色（37℃；避光15 min），最后加入25 μL 的3 mol/L NaOH 终止显色。iMark 酶标仪双波长（405 ～450）nm 检测，读取吸光值。SPSS 26.0软件分析比较亲和力差异。

1.6 RNAi 及生物测定

RNAi 相关试验参考赵丹方法［20］。根据T7 RiboMAX™ Express RNAi System 说明书，分别设计HcABCC4基因的dsRNA 引物，以gfp为对照。由生工合成dsRNA 需要的正向、反向引物（见表1），以美国白蛾四龄cDNA 为模板，进行PCR 扩增，纯化回收后，通过Promega T7 RiboMAX™ Express RNAi System 试剂盒，体外转录合成dsRNA，转录体系参考说明书。

表1 HcABCC4 基因dsRNA 引物Table 1 Primers for dsRNA of HcABCC4 gene

采用注射法进行试验，注射完成3 d 后，提取处理组RNA，合成cDNA，qRT-PCR 检测不同处理美国白蛾HcABCC4基因表达量。SPSS 26.0 进行差异显著性分析。

将注射dsRNA 3 d 后的美国白蛾幼虫转移至含有LC70的Bt Cry9Ea10 蛋白饲料，每处理20 头幼虫进行生物测定，重复3 次，逐日统计幼虫死亡情况。SPSS 26.0 统计分析HcABCC4基因沉默前后Bt Cry9Ea10 蛋白对美国白蛾毒力变化，分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白对美国白蛾的杀虫活性测定

生物测定结果显示，Bt Cry9Ea10 和Bt Cry 1Ac蛋白对美国白蛾幼虫均有杀虫活性，毒力回归方程分别为y=-4.61+2.28x、y=-4.90+2.376x，LC50和LC70值分别为115.60、104.58 μg/mL 和177.58、192.15 μg/mL。由此推断，Bt Cry9Ea10 蛋白对美国白蛾的毒力与Bt Cry 1Ac 蛋白相当。

2.2 美国白蛾HcABCC4 蛋白系统发育树构建

经GenBank 检索， 得到16 个鳞翅目昆虫ABCC4 氨基酸序列，HcABCC4 和其他15 种鳞翅目昆虫的ABC 转运蛋白氨基酸序列构建的系统发育树如图1。结果显示，美国白蛾HcABCC4氨基酸序列与夜蛾科害虫棉铃虫H.armigera（XM 049842273.1）、 美洲棉铃虫H.zea（XM 047179823.1）、 草地贪夜蛾S.frugiperda（XM 035574947.2）和斜纹夜蛾S.litura（KP335688.1）的ABCC4 氨基酸序列聚为一支，相似性一致，支持率为98%。根据目前ABCC4 已知序列推断，美国白蛾HcABCC4 与夜蛾科昆虫ABCC4 亲缘关系最近，而与其他鳞翅目昆虫的亲缘关系较远。

图1 基于氨基酸序列构建的美国白蛾与15 种鳞翅目昆虫ABCC4 的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of ABCC4 between H.cunea and other insects from Lepidoptera based on amino acid sequences

2.3 Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白与重组HcABCC4 TMD 的结合能力分析

Ligand blot 分析结果表明，Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白与HcABCC4 TMD 重组蛋白能够特异结合（图2）。ELISA 蛋白亲和力测定结果表明，结合信号随蛋白浓度增加而增强，且结合存在饱和现象；Bt Cry9Ea10、Cry1Ac 蛋白与HcABCC4 TMD 重组蛋白的解离常数Kd 值分别为（276.80 ±0.056）、（131.30±0.087）nmol/L，最大亲和力Bmax 为（0.23±0.06）、（0.86±0.086）（见图3）。

图2 HcABCC4 TMD 蛋白与Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 的配体印记实验Fig.2 Ligand blot analysis of Bt Cry9Ea10, Cry1Ac and HcABCC4 TMD proteins

图3 Bt Cry9Ea10、Bt Cry1Ac 与 HcABCC4 TMD 蛋白的亲和力测定Fig.3 Affinity between Bt Cry9Ea10 and Bt Cry1Ac with HcABCC4 TMD protein

由图3 可知，Bt Cry9Ea10 与HcABCC4 TMD的解离常数Kd 值高于Cry1Ac 的Kd 值，表明Bt Cry9Ea10 与HcABCC4 TMD 间亲和力较弱。推测HcABCC4 为Bt Cry9Ea10 毒素的中肠受体蛋白。

2.4 美国白蛾HcABCC4 在Bt Cry9Ea10 蛋白杀虫中的功能研究

2.4.1 沉默效率检测 合成dsRNA，经分光光度计检测dsgfp、dsHcABCC4的浓度分别为10 582.3、8 681.1μg/mL，A260/A280分别为1.95、2.02，浓度与质量均符合要求，可用于注射幼虫。HcABCC4沉默结果显示，注射dsHcABCC4的幼虫靶标基因表达水平下降了58.04%（图4），且与对照间差异显著（P＜0.05），表明已成功沉默HcABCC4，且沉默效率高。

图4 美国白蛾幼虫dsRNA-gfp/-HcABCC4 沉默后基因的表达水平Fig.4 Gene expression levels in the larvae of H.cunea after injection with dsRNA-gfp or -HcABCC4

2.4.2 沉默HcABCC4基因后美国白蛾对Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性变化HcABCC4基因沉默后美国白蛾幼虫对Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性试验表明，分别沉默HcABCC4、gfp基因后Bt Cry9Ea10 蛋白对美国白蛾的校正死亡率分别为26.7%和65.1%（见图5），平均校正死亡率下降58.97%（P＜0.05）。由此证明，HcABCC4 蛋白是Bt Cry9Ea10 的中肠受体蛋白。

图5 美国白蛾幼虫dsRNA-gfp/-HcABCC4 沉默后对Bt Cry9Ea10 蛋白的敏感性Fig.5 Sensitivity of H.cunea larvae to Bt Cry9Ea10 protein after injection with dsRNA-gfp or -HcABCC4

3 结论与讨论

美国白蛾自传入我国后，对我国的生态环境、经济发展及生物安全均造成了严重危害［1-2］。苏云金芽胞杆菌（Bt）是应用最成功的生防微生物。在多种害虫防控上，已鉴定多种中肠受体蛋白与Bt Cry 蛋白特异性结合，影响Bt Cry 蛋白对害虫的毒力。已有研究表明Bt Cry9 类蛋白对多种鳞翅目害虫有较高毒力［13］。而有关Bt Cry9 类蛋白与昆虫中肠受体蛋白互作机制研究仍很有限。由于昆虫与Bt 杀虫毒素互作机理表现出种间差异性［5,21］，因此，无法根据现有文献推断Bt Cry 蛋白对美国白蛾的中肠蛋白受体类型。本研究利用生物测定、配体印记杂交和基因沉默等技术对美国白蛾与高毒力Bt Cry9Ea10 毒素互作机制进行了研究，研究结果将为生产提供高效Bt 毒素蛋白，也为构建二代转基因抗美国白蛾林木提供候选基因。

2010 年首次发现昆虫ABC 转运蛋白是Bt Cry蛋白的重要受体蛋白［5］，而有关美国白蛾ABC 类受体研究尚未见报道。本研究配体印记杂交试验表明，Bt Cry9Ea10 蛋白与HcABCC 结构域TMD 重组蛋白发生特异结合，通过RNAi 技术对HcABCC4进行沉默后，进行美国白蛾幼虫Bt Cry9Ea10 蛋白蛋白敏感性试验发现Bt 毒素的敏感性显著下降。说明美国白蛾ABCC4蛋白是Bt Cry9Ea10的重要受体，同时通过数据库分析，该蛋白还是农药的重要受体，因此，该基因的克隆表达为研究美国白蛾对农药抗性也提供了重要参考。