基于ISSR 分子标记的铃铛铁线莲品种杂交F1 代鉴定

耿宇航，周欣莹，贾艳艳，孙浩男，刘冬云

（河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000）

毛茛科（Ranunculaceae）铁线莲属（Clematis）植物大多为藤本植物，观赏价值极高，不仅常被用于篱垣廊架的垂直绿化和装饰，还可用于地被、盆栽等［1］。其植株姿态优雅，花色艳丽，花型丰富，有平展呈盘状、钟状、半钟状及铃铛状，单瓣或重瓣，花期较长，全年不同品种可交替开花［2-3］。我国铁线莲种质资源丰富，几乎涵盖了铁线莲属所有类型［4］。根据英国皇家园艺协会的分类，目前市场上常见的园艺品种可以分为：全缘组、南欧组、佛罗里达组、德克萨斯组和长瓣组等［5］。德克萨斯组铃铛型铁线莲为多年生草质藤本，花单生，花型精巧，杯型，似“小铃铛”，下垂，萼片4 枚，茎叶纤细，花色丰富，萼片反卷程度不同，上下萼花色不同，萼片边缘有波浪状起伏，观赏价值高，花期长，适应性强。根据在华北地区栽种的表现，铃铛铁线莲花期为5—9月，在夏季高温天气仍然能保持小铃铛般优雅的姿态，为华北地区垂直绿化提供新的选择，但由于铁线莲育种年限漫长［6］，基因型高度杂合，后代分离广泛［7］，只依靠形态学特征探究其真实性及遗传特性会大大降低其育种效率。

国内外学者对铁线莲属植物的研究仍然以大花铁线莲为主［8］，而有关铃铛铁线莲的研究较少。铃铛铁线莲品种多产于北美和日本，其主要亲本包括革花铁线莲（C.viorna）等，国内也有部分花型相似野生种，如褐毛铁线莲（C.fusca）、芹叶铁线莲（C.aethusifolia）、甘青铁线莲（C.tangutica）等，褐毛铁线莲和甘青铁线莲早自19 世纪被引入欧洲［9］，可能也参与了铃铛铁线莲的育种进程。有性杂交育种仍然是铁线莲属植物品种创新的最主要的、效果显著的途径［8,10］，但国内铁线莲育种起步较晚，与国外育种研究差异较大［11］。限制铃铛铁线莲杂交育种的主要因素包括败育［5］、育种年限漫长等，而利用分子标记对其杂交F1代进行鉴定，可以在植株生长早期从分子角度鉴定其是否为真杂种，较形态学鉴定更加稳定、快捷和准确。目前，分子标记技术已广泛应用于铁线莲属植物亲缘关系及遗传变异分析的研究中，如ISSR［12-13］、SSR［14］、RAPD［15］等，但对于其杂交子代，目前仅有杂交座果率和结实率、子代表型等研究［6,16-17］，Yuan 等［18］利用RAPD 技术对卷萼铁线莲（C.tubulosa）和短尾铁线莲（C.brevicaudata）的杂交F1代进行了分子鉴定，其他分子鉴定研究鲜有所见。ISSR 分子标记技术是目前常用的分子生物学分析手段之一，它将SSR 和AFLP 的许多优点与RAPD 的普遍性结合起来，具有多态性良好、成本低、操作便捷等特点［19-20］。本研究利用ISSR 分子标记技术对铃铛铁线莲杂交F1代幼苗进行真实性鉴定及遗传多样性分析，旨在为铃铛铁线莲新品种选育、指纹图谱构建等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料中6 个铃铛铁线莲品种分别为‘蓬巴杜’‘妙福’‘索菲亚’‘安尼萨’‘斯嘉丽’和‘胭脂扣’（图1）。将6 个品种进行组配后进行常规人工杂交，获得结实数、有胚率及发芽率如表1 所示，挑选长势较为良好的F1代取材0.2 g 叶片，共获得37 份杂交F1代材料。

表1 杂交组合信息Table 1 Information of hybrid combinations

图1 杂交亲本材料Fig.1 Flowers of the hybrid parents

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取与检测 采用新型植物基因组DNA 提取试剂盒（CW0531M，康为世纪），按照说明书步骤提取亲本和子代的DNA，将检测合格的DNA 模板及引物浓度分别稀释成50 ng/μL、10 μmol/L 的工作液，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 特异性引物的筛选及PCR 扩增 本试验参照王鑫［11］对铁线莲属植物的ISSR 引物及ISSR-PCR反应的扩增程序进行操作，引物及序列如表2 所示。挑选多态性良好的12 条引物进行亲本特异性筛选。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，退火温度依据引物设定，72 ℃延伸1 min，设置PCR 反应总程序共40 个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用FR-2000 成像系统上观察并保存图像。

表2 12 条多态性高的ISSR 引物Table 2 12 ISSR primers with high polymorphisml

1.2.3 子代真实性鉴定 用筛选出的多态性高、且具有父本特异性条带的引物组合对供检验的37 个F1代进行杂交子代身份真实性鉴定。参照文献［21］的判定标准，子代PCR 产物中产生与父本一致条带或出现不同于父母本的条带类型即为真杂种，若产生母本一致条带则为假杂种或自交种。从扩增的电泳图中选择清晰可重复的条带，同位点上有条带的记“1”，无条带的记“0”，转化为1、0 矩阵，利用利用 Popgene 32 软件计算等位基因数（Na）等指数，利用 NTsys 2.10 软件分析，使用UPGMA 法绘制聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 的纯度检测

对37 份杂交F1 代材料提取DNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度（图2），所提取DNA 条带清晰无拖带，其OD 值的结果均在1.7 ～2.2 之间，说明DNA 纯度较高、无蛋白质和RNA 污染，可以投入试验继续使用。

图2 37 份杂交F1 代DNA 基因组电泳检测结果Fig.2 Electrophoresis results of genomic DNA from 37 hybrids

2.2 ISSR 标记特异性条带鉴定

由图3 和表3 可知，12 条引物在铃铛铁线莲杂交亲本和F1代中可产生多个片段，多态性高，均可表现父本特异性，观察到的特异性条带可用作评估杂种纯度的标记，利用能够表现父本特异性的引物进行下一步杂种的鉴定。

表3 不同杂交组合的引物筛选结果Table 3 Filtering results of different primer combination

图3 6 个杂交组合在引物下的部分PCR 扩增电泳图谱Fig.3 Partial PCR amplification results of 6 hybridization combinations

2.3 后代扩增结果和分析

在ISSR 鉴定结果中，只有成功扩增出每个杂交组合中父本的特异性条带的引物才可被认定是验证该杂交子代真实性的引物。杂种和亲本共43 份材料，在上述特异性引物检测下条带主要分布在250 ～2 000 bp，条带统计结果如表所示（表4）。37 份材料均具有丰富的遗传多样性，F1代与亲本共有条带占多数，但也有X38 和X55 组合中子代条带与父本共有偏多，说明这些杂交F1代得到父本的遗传物质较多，也说明了产生的F1代为真杂种；杂交F1代出现的多态性条带分别来自父本或母本，说明不同子代遗传了父母本不同的遗传物质，同时有些子代还出现了双亲均无的条带，说明在杂交过程中，可能由于基因重组发生了新的变异。

表4 杂交F1 代的ISSR 扩增位点统计信息Table 4 Statistical information of ISSR amplified loci of F1 hybrid

2.4 遗传多样性分析

采用多个遗传参数对铃铛铁线莲杂交后代遗传多样性进行分析，结果显示，铃铛铁线莲亲本和F1代的等位基因数范围在1.829 ～1.939 之间，等位基因数在1.410 ～1.639 之间、基因多样性为0.251 ～0.362 之间、多样性信息指数为0.385 ～0.531之间，基因库较为丰富。

植物间遗传相似系数越大，说明遗传背景越相似。铃铛铁线莲亲本和子代之间的遗传相似性系数在0.400 ～0.771 之间，F1代与亲本相差较大的为X155 杂交组合（表5），变动幅度为0.371，其中D5 与父本‘安尼萨’亲缘关系最远，相似性系数为0.400，D3、D4、D6 与母本‘索菲亚’最为相似，相似性系数为0.771。F1代之间相似性系数相差较大的为X162 组合，7 个F1代遗传相似性系数在0.523 ～0.886 之间，平均相似性系数为0.702，其中，D5 和D6 亲缘关系最近，相似性系数可达0.886，D4 和D9 相似性系数最低，为0.523。由此可见，F1代和亲本之间、F1代之间都存在着丰富的遗传变异。

表5 ISSR 标记的X155 组合中亲本与杂交F1 代遗传相似性系数Table 5 Genetic similarity coefficients between parents and F1 hybrids in the X155 combination marked by ISSR

2.5 聚类分析

根据遗传相似性系数矩阵，利用UPMGMA 法进行聚类分析，构建聚类分析树状图（图4）。从树状图看出，铃铛铁线莲F1代杂种和父母本的遗传相似系数在0.420 ～0.770 之间，变动幅度为0.350，杂交F1代和亲本可大致都分为2 类，X38、X155、X168 组合中F1代为偏父型，X18、X55、X162 组合中F1代为偏母型。在X18 组合中，亲本和F1代的遗传相似系数在0.510 ～0.820 之间，以遗传相似系数0.542 为阈值，亲本和子代可分为2 大类，第1类为母本‘妙福’和7 个子代，第2 类为父本‘蓬巴杜’，其中子代中的A4 和A7 最为相似，相似性系数达0.820，A4、A7、A1、A5 与母本的亲缘关系较近。在X38 组合，亲本和6 个杂交F1代的遗传相似系数在0.480 ～0.890 之间，以遗传相似系数0.568 为阈值，亲本和子代可分为2 大类，第1 类为母本‘苏菲’，第2 类为父本‘蓬巴杜’和杂交F1代，而在第2 个分支中，F1代先聚为1 类，再与父本聚为1 个分支，表明F1代都为偏父型，与父本亲缘关系较近，但杂交F1代之间又比其在双亲间亲缘关系更近，其中子代B3 和B6 最为相似，遗传相似性系数可达0.900。

图4 6 个杂交组合亲本和子代的UPGMA 聚类图Fig.4 UPGMA clustering of parents and hybrids of the 6 hybrid combination

3 讨论

杂交可以继承父母本的优良性状，还可以创造新的优良性状，丰富物种遗传多样性。对于铃铛铁线莲的生物学特性来说，对铃铛铁线莲杂交后代进行早期鉴定是十分必要的，利用分子鉴定能够较早地剔除假杂种，为进一步育种工作的展开提供依据［22］。12 条引物在铃铛铁线莲中都能扩增出多态性高且具有特异性的条带，但不同品种的特异性引物有所区别。F1代在引物的扩增下，均遗传了父本的特异性条带或产生了新的带型，为真杂种，且多数条带都来自于亲本，出现了父母本条带结合的情况，例如X18、X168 组合，双亲共有条带可占比45.38%、52.20%，说明这些F1代融合了父母本的遗传物质，可能表型会更加丰富。但也有F1代在引物的扩增下出现了新的条带，即产生了父母本均不具有的条带类型，尤其是X38 和X162 组合中，分别出现了25 和28 个新位点，说明杂交后代的基因发生了重组，可能会产生新的性状，原因可能是父母本杂合性较高，不同长度的等位核苷酸序列之间形成了异源双链体，表现为不同于亲代的新位点，这在Dongre［23］对棉属（Gossypium）杂种后代的鉴定、Jade［24］对珍珠粟（Pennisetum glaucum）和象草（(Pennisetum purpureumSchumach）种间杂种后代的研究中都出现了相似的情况。

铃铛铁线莲37 个F1代真杂种单株和父母本的遗传相似系数变化范围为0.400 ～0.771，变动幅度为0.371，说明铁线莲杂交F1代具有较丰富的遗传变异性。ISSR 聚类图分析结果表明这6 个组合出现了不同的偏向父母本的情况，X18、X55、X162为偏母型，和母本亲缘关系较近的原因可能是细胞质基因在遗传性状的表达中发挥了作用［25］；而X38、X155、X168 都为偏父型，推断可能是在杂交过程中发生了染色体的不均衡分配，一些DNA 片段的插入所导致［26］。而Carvalho［27］在对小麦族（Triticeae）种间杂交F1代遗传关系进行分析时，也出现了不同杂交组合偏向不同父母本的现象。

在杂交过程中发现，温度降低会延长铃铛铁线莲杂交种的成熟时间，且铃铛杂交成熟种存在休眠时间过长的现象，有的可长达1 年，但余伟军［9］发现，在杂交种由绿变黄时取下，随取随播可以减少种子休眠物质的积累，可以起到促进铃铛铁线莲杂种萌发的作用。在试验中还发现以‘蓬巴杜’品种作为杂交组合的母本，结实率高，出苗时间较早，长势较快，Xu［28］等对白桦（Betula platyphylla）杂种后代进行分析研究后发现以白桦系Q3 作为杂交组合的母本，其后代具有较强的性状，身高和直径表现较好；Gupta［29］也发现珍珠粟（Pennisetum glaucum）杂交F1代的杂种优势和G4R、G10B 等亲本有关。待F1代植株成熟后，可结合其形态特征进行进一步分析，为未来其育种做准备。

4 结论

本研究首次利用ISSR 分子标记对铃铛铁线莲杂交F1代进行真实性鉴定和遗传多样性分析，37 个F1代均为真杂种，获得亲本结合的遗传物质较多，还产生了新的遗传物质，具有产生遗传变异的特点，且遗传多样性丰富。F1代在基因上出现了明显偏向某一方的现象，为后续杂交亲本选择与选配提供借鉴。ISSR 分子标记可有效地在铃铛铁线莲杂交后代生长早期用于鉴定其是否为真杂种，为铃铛铁线莲新品种选育、指纹图谱构建等提供分子依据。