金丝桃苷抑制Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子-κB信号通路减轻牙周炎大鼠牙周组织损伤实验研究

张 晶,贾翠楠,何 冰,李彬琦,巩兰平

(邯郸市中心医院口腔科,河北 邯郸 056000)

牙周炎是一种慢性炎症性疾病,其主要特征为牙龈炎症、牙槽骨吸收、牙周组织退化等,是常见的口腔疾病[1-2]。牙周炎随着年龄增长其发病率持续升高,随着我国人口老龄化的加剧,牙周炎严重威胁着人们的口腔健康[3]。如何利用药物巩固经典治疗手段的治疗效果是目前口腔医生面对的主要问题。金丝桃苷是一种黄铜醇苷类化合物,在金丝桃科、桔梗科、蔷薇科等多种植物中广泛存在,其具有多种生物活性,包括抗炎、抗氧化和心肌保护作用,在多种疾病中发挥重要作用[4]。已有研究[5]报道,金丝桃苷具有促进大鼠成骨分化、骨髓间充质干细胞增殖的作用,对牙周炎具有潜在治疗特性。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路与炎性反应密切相关。据报道,金丝桃苷可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来减轻复发性流产大鼠炎性反应[6]。但金丝桃苷是否可通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路治疗牙周炎尚未可知。因此,本研究基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探究金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级SD雄性大鼠,10周龄,体重341～369 g,购自上海博湖生物技术有限公司,动物生产许可证号SCXK(沪)2020-0014,大鼠在室温22～27 ℃,湿度52%～62%,昼/夜各12 h循环照明的环境中饲养,自由饮水、摄食。本研究经本院伦理委员会批准。金丝桃苷(批号NJ528-44,原料药,纯度≥99.83%,与0.9%氯化钠溶液配制成浓度为3 mg/ml的混悬液)购自嘉兴南箭生物材料有限公司;脂多糖(批号HX28504,与0.9%氯化钠溶液配制成浓度为0.04 mg/ml的混悬液)、标准菌混合悬液(批号HX25119)、HE染色试剂盒(批号HX25115)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(批号HX41159)、蛋白裂解液(批号HX44106)、ECL试剂(批号HX59259)均购自苏州泓迅生物科技有限公司;大鼠骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)(批号DH20400)、NF-κB受体活化因子配体(RANKL)(批号DH42815)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(批号DH58185)、白介素-6(IL-6)(批号DH69004)ELISA试剂盒均购自广州达晖生物技术有限公司;Trizol试剂(批号ZJ41955)、逆转录试剂盒(批号ZJ58295)、PCR试剂盒(批号ZJ68194)、BCA试剂盒(批号ZJ40220)均购自福州载基生物科技有限公司;兔源TLR4(批号RN42611)、MyD88(批号RN69192)、NF-κB(批号RN53150)、GAPDH(批号RN44359)一抗、羊抗兔二抗(批号RN67392)均购自杭州然钠生物科技有限公司。显微镜(型号BM1650A)、酶标仪(型号Infinite 200 Pro)、荧光定量PCR仪(型号Quant Studio 3)、凝胶成像系统(型号Quick Gel 6200)均购自江苏楚天生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牙周炎大鼠模型的构建及分组给药:构建牙周炎大鼠模型[7],麻醉大鼠,选用0.2 mm的正畸钢丝在第1、2磨牙间隙中穿过,结扎双侧上颌1、2磨牙牙颈部,将结扎线深埋入大鼠牙龈沟,同时于牙龈沟接种浓度为109CFU/ml的4种标准菌混合液。结扎1周后检查钢丝是否牢固,8周后若大鼠牙周可见牙龈红肿、探诊易出血,有深牙周袋形成则表明牙周炎大鼠造模成功。将45只建模成功的大鼠随机分为模型组、金丝桃苷(30 mg/kg)组[8]、金丝桃苷(30 mg/kg)+TLR4激活剂(脂多糖,0.4 mg/kg)组[9],每组15只,另取15只健康大鼠作为对照组。建模结束后,金丝桃苷组大鼠腹腔注射30 mg/kg的金丝桃苷[8];金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠于腹腔分别注射30 mg/kg金丝桃苷和0.4 mg/kg脂多糖[9];对照组、模型组大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液,各组给药每天1次,连续4周。

1.2.2 标本采集:末次给药结束24 h后,麻醉大鼠,腹主动脉取血,4 ℃下4400 r/min离心16 min,取上清,置于-80 ℃冰箱中保存,随即断头处死大鼠,分离牙周组织,取部分牙周组织置于-80 ℃冰箱中保存,剩余牙周组织固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 HE染色观察各组大鼠牙周组织病理学变化:取固定于4%多聚甲醛中的大鼠牙周组织,石蜡包埋,切片(4 μm),取部分切片,HE染色,每张切片随机观察6个视野,光镜下观察。

1.2.4 TRAP染色检测大鼠牙周组织破骨细胞数量:取其余切片,TRAP固定液固定60 s,使用TRAP染色试剂盒染色,脱水封片后,每张切片随机观察6个视野,在光镜下计数破骨细胞数量(破骨细胞细胞质被染为红色,细胞核被染为蓝色),取平均值。

1.2.5 ELISA法检测各组大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表达水平:取冻存大鼠血清,低温融化,按照OPG、RANKL、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒说明书,检测大鼠血清中OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表达水平。

1.2.6 荧光定量PCR法检测各组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平:取冻存大鼠牙周组织,加入液氮研磨,Trizol试剂提取大鼠牙周组织总RNA,逆转录为cDNA,荧光定量PCR法检测大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平,以GAPDH为内参。反应体系为:cDNA 2 μl、缓冲液5 μl、dNTPs 4 μl、正反向引物各1 μl、DNA聚合酶1 μl、ddH2O 16 μl。反应程序为:95 ℃预变性10 min,然后进行40个循环(95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 60 s),72 ℃延伸10 min。引物由郑州乐睿生物技术有限公司设计、合成,引物序列见表1。被测mRNA相对表达量计算方法采用基因定量方法(2-ΔΔCt法)。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印迹法检测各组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平:取大鼠冻存牙周组织,研磨,加入蛋白裂解液提裂解,BCA法定量总蛋白,电泳、转膜、封闭,然后将膜与稀释好的兔源TLR4(1∶1500)、MyD88(1∶1200)、NF-κB(1∶1100)、GAPDH(1∶1900)一抗在4 ℃下孵育过夜,然后将膜暴露于稀释好的羊抗兔二抗(1∶2100)中,室温孵育2 h,加入ECL试剂检测蛋白质印迹,Image J软件分析蛋白条带灰度值,以GAPDH为内参,计算TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织病理学变化的影响 对照组大鼠牙周组织结构正常;模型组大鼠牙周组织炎性细胞浸润明显,伴随骨吸收陷窝数量增多;与模型组相比,金丝桃苷组大鼠牙龈上皮较完整,炎性细胞浸润程度较轻,骨吸收陷窝减少;与金丝桃苷组相比,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠牙周组织炎性细胞浸润程度加深,骨吸收陷窝增多。见图1。

2.2 金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织破骨细胞数量的影响 与对照组相比,模型组大鼠牙周组织破骨细胞数量显著升高(P<0.05);与模型组相比,金丝桃苷组大鼠牙周组织破骨细胞数量显著降低(P<0.05);与金丝桃苷组相比,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠牙周组织破骨细胞数量显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠牙周组织破骨细胞数量比较(个)

2.3 金丝桃苷对牙周炎大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表达水平的影响 与对照组相比,模型组大鼠血清OPG水平显著降低(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平显著升高(均P<0.05);与模型组相比,金丝桃苷组大鼠血清OPG水平显著升高(P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平显著降低(均P<0.05);与金丝桃苷组相比,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠血清OPG水平显著降低(均P<0.05),RANKL、TNF-α、IL-6水平显著升高(均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清OPG、RANKL、TNF-α、IL-6表达水平比较

2.4 金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平的影响 与对照组相比,模型组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,金丝桃苷组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平显著降低(P<0.05);与金丝桃苷组相比,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较

2.5 金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的影响 与对照组相比,模型组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,金丝桃苷组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平显著降低(P<0.05);与金丝桃苷组相比,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较

3 讨 论

牙周炎能致使人牙齿缺失,是一种破坏性疾病,其不仅对人们的口腔健康有严重危害,也与全身系统疾病的发生紧密相关,例如心脏病、糖尿病、骨质疏松症等[10-11]。尽管近年来对牙周炎的研究进展较快,但其发病率仍然呈现上升的趋势[12],因此,深入探究牙周炎的发病机制,寻找治疗牙周炎有效的方法、药物具有重要意义。本研究通过结扎大鼠双侧上颌1、2磨牙牙颈部建立牙周炎大鼠模型,结果发现,与健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙槽骨吸收,可见大量炎性细胞浸润,出现大量骨吸收陷窝,TNF-α、IL-6水平升高,与陈晨等[7]研究结果类似,说明牙周炎大鼠建模成功。牙槽骨吸收是牙周炎的一种临床表现,当牙槽骨骨形成速度低于骨吸收速度,牙周炎患者的牙齿将会松动,这也是导致牙齿缺失的主要原因之一[13-14]。OPG能抑制破骨细胞形成及骨吸收,这与RANKL的作用相反,OPG水平升高、RANKL水平降低即表明牙槽骨吸收被阻断,牙周组织损伤得到抑制[15]。本研究发现,同健康大鼠比,牙周炎大鼠牙周组织破骨细胞数量、血清RANKL水平升高,血清OPG水平降低,提示牙周炎大鼠牙周组织牙槽骨吸收加速,牙周组织发生损伤。

金丝桃苷是一种广泛存在于各种植物内的天然黄酮类化合物,已有文献报道,金丝桃苷对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症和细胞凋亡具有抑制作用[16],其也能够提高IL-1β诱导的小鼠骶髂关节软骨细胞活性,抑制炎性因子和细胞外基质紊乱[17]。本研究发现,使用金丝桃苷处理牙周炎大鼠后,大鼠牙周组织病变减轻,牙周组织破骨细胞数量、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平显著降低,血清OPG水平显著升高,与Xu等[5]研究结果一致,说明金丝桃苷可能通过减少破骨细胞的形成和牙槽骨吸收,抑制炎性反应,来改善牙周炎大鼠的牙周组织损伤。

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在多种细胞中广泛存在,是炎性反应关键通路,抑制该通路可阻断多种疾病的发生发展进程[18-19]。相关研究表明,阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化可减轻牙周膜细胞炎症[20];本研究发现,与健康大鼠相比,牙周炎大鼠牙周组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平明显升高,提示TLR4/MyD88/NF-κB通路可能参与了牙周炎大鼠牙周组织损伤,该通路可能处于激活状态,其促进了牙周组织的骨吸收、抑制骨形成。与模型组相比,金丝桃苷组大鼠牙周组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白水平显著降低,推测金丝桃苷可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻牙周炎大鼠的牙周组织损伤。为了验证该推测,本研究利用TLR4激活剂脂多糖进行干预,结果发现,与金丝桃苷组比较,金丝桃苷+TLR4激活剂组大鼠牙周组织损伤以及骨吸收加重,牙周组织破骨细胞数量、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表达水平、血清RANKL、TNF-α、IL-6水平显著升高,OPG水平显著降低,说明TLR4激活剂可部分逆转金丝桃苷对牙周炎大鼠的改善效果,进一步表明金丝桃苷可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,调控炎症以及骨吸收相关因子表达,促进牙槽骨修复,改善牙周炎大鼠牙周组织损伤。

综上所述,金丝桃苷可缓解牙周炎大鼠牙周组织损伤,抑制大鼠炎性反应和牙槽骨吸收,其机制与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。但本研究未对牙周炎大鼠的氧化应激相关指标进行检测与分析,且未对通路的上下游调控因子进行更深入的探究,不能确定金丝桃苷对牙周炎大鼠牙周组织损伤的改善作用是否与氧化应激以及通路上下游调控有关,对此,后续将针对不足之处进行相关实验设计,以完善金丝桃苷对牙周组织损伤的机制研究。