茶多酚对高温下猪睾丸间质细胞损伤及睾酮分泌异常的缓解作用

何芝凤，李芳芳，胡传活*，赵欢欢，赵文婧，黄明光

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004；2. 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室，广西 南宁 530004；3. 广西畜禽品种改良站，广西 南宁 530001；4. 广西畜牧站，广西 南宁 530022)

在高温环境中，由于猪皮下脂肪厚，散热能力差，极易出现热应激反应，进而降低猪的生产和繁殖性能，这给养猪业带来巨大挑战，同时也造成严重的经济损失。其中一个很重要原因是高温通过降低精子活力影响公猪的生育力，从而间接影响母猪的胚胎存活率[1-2]。有研究发现，热应激可引起猪睾丸细胞活性氧升高，细胞水肿，线粒体严重变性[3]。

高温高湿环境下，仔猪体温41 ℃会出现中暑现象，40 ℃高温环境对公猪睾丸细胞造成氧化损伤并通过上调半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)促进睾丸间质细胞的凋亡[4-5]。睾丸间质细胞产生的睾酮对雄性生育能力十分重要，可直接作用于其他体细胞从而间接影响生殖细胞并促进精子的发生[6]。

茶多酚(tea polyphenol，TP)是多羟基酚类化合物，具有较强的抗氧化性，按化学结构可将其分为4类，即儿茶素类、黄酮类、花青素类和酚酸类[7]。研究发现，TP作为绿色饲料添加剂在猪生产中能够改善繁殖性能，可保护卵母细胞免受氧化应激损伤和增强母猪免疫机能以及提高母猪血清中孕酮浓度[8]。在公猪生产繁殖上发现TP的抗氧化功能有助于精液保存[9-10]。而对于睾丸间质细胞，体外研究发现TP抑制大鼠睾酮的分泌[11]；也有学者通过体内体外试验发现TP具有促进大鼠睾酮产生的作用[12]，但对于高温条件下，TP对猪睾丸间质细胞损伤的保护作用及功能影响，目前尚无研究报道。因此，为了提高规模养殖条件下公猪新鲜精液的质量，在前人研究的基础上，本试验采用41 ℃对仔猪睾丸间质细胞进行热处理模型构建，探究TP在高温条件下对公猪睾丸间质细胞损伤的影响，为TP在公猪生产繁殖上的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

睾丸选自广西大学动物医院附近猪场2～3周龄三元杂交仔猪。TP(上海源叶，高纯98%)；CCK8和TRIzol(苏州新赛美生物科技有限公司)；荧光定量试剂盒和反转录试剂盒(镇江爱必梦生物科技有限公司)，Caspase-3、热休克蛋白70(Hsp70)、细胞色素C(Cytc)和睾酮 ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；胶原酶Ⅳ(北京索莱宝科技有限公司)；PBS、DMEM-F12细胞培养基、胎牛血清(以色列BI公司)。

酶标仪(BIO-RAD公司)；细胞培养箱和荧光显微镜(Thermo Fisher Scientific公司)；荧光定量PCR仪(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 睾丸间质细胞的分离培养

参考卿利娟等[13]的方法分离培养仔猪睾丸间质细胞。将阉割的仔猪睾丸在2 h内运回实验室，用无菌器具剥离出睾丸间质组织，并将其剪碎至1 mm3左右的小块，加入适量胶原酶Ⅳ消化液(1 mg胶原酶Ⅳ+1 mL DMEM/F12细胞培养基)在37 ℃下消化20 min。再加入等体积的完全培养基(10%胎牛血清+5%马血清+1%青/链霉素+84% DMEM/F12细胞培养基)终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。加入适量完全培养基，用200目筛网过滤，获得的细胞悬液离心去上清液，并用PBS清洗2遍。向细胞沉淀中加入适量完全培养基吹打混匀，以1×106个细胞/mL的细胞密度接种于六孔板中，小心放入37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2 细胞分组及处理

将细胞设置为空白(Blank，置于37 ℃培养箱)组，热(Heat，置于41 ℃培养箱热处理6 h)处理组，热+TP(Heat+TP，待细胞密度在80%左右，先加入TP预孵24 h，再置于41 ℃培养箱热处理6 h)处理组。TP浓度筛选：依次向96孔板中加入TP稀释液，浓度分别为0.5、1、3、6、9、27、81和243 μg·mL-1。

1.2.3 细胞存活率的检测

将处理后的每组细胞按照CCK8说明书的方法，弃掉原上清液，按照CCK8∶DMEM/F12=1∶9，每孔100 μL配制液加入，置于培养箱中2 h，然后在酶标仪波长为450 nm下测定各孔的吸光度。

1.2.4 ROS水平的检测

参照说明书的方法，按荧光探针DCFH-DA∶细胞培养基DMEM/F12=1∶1 000配制荧光探针DCFH-DA稀释液，加入适量该探针稀释液于不同分组中，37 ℃避光孵育20 min，然后用细胞培养基DMEM/F12洗涤3次，置于荧光显微镜下并设置同样曝光条件拍照记录，随后用ImageJ软件对图片进行荧光分析。

1.2.5 Bcl-2、Bax、Hsp70、Caspase-3、Cytc mRNA表达量的测定

向处理过的细胞中加入TRIzol提取RNA，并用反转录试剂盒反转录成cDNA，将Gapdh作为内参基因，用荧光定量PCR法检测Hsp70和凋亡相关基因Cytc、Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA表达水平。具体反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，并用2-ΔΔCt法进行组间计算，引物序列如表1。

表1 荧光定量PCR引物信息

1.2.6 Caspase-3、Hsp70、Cytc和睾酮浓度的测定

取处理后的各组细胞及上清液，参照ELISA试剂盒说明书的要求处理，测定Caspase-3、Hsp70、Cytc和睾酮浓度。

1.3 数据统计与分析

试验重复3次，用SPSS 23软件进行单因素方差分析，并用软件Prism 6.01作图，数据以“平均值±标准差”表示，以P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 TP对细胞存活率的影响

由图1可知，热处理组细胞存活率极显著低于空白组(P<0.01)，表明高温热处理引起猪睾丸间质细胞活性抑制，且通过不同浓度的TP预处理，与热处理组相比，发现浓度为1 μg/mL的TP对细胞保护性最好，极显著地提高了细胞存活率(P<0.01)。

ns表示P>0.05，##与**表示P<0.01。下同。

2.2 TP对Hsp70浓度的影响

由图2可以看出，与空白组相比，热处理组细胞内Hsp70浓度极显著升高(P<0.01)；与热处理组相比，1 μg/mL TP热处理组内Hsp70浓度显著降低(P<0.01)。

图2 TP对Hsp70浓度的影响

2.3 TP细胞ROS水平的影响

从图3可以看出，热处理组ROS荧光水平极显著高于空白组(P<0.01)，1 μg/mL TP热处理组的ROS水平极显著低于热处理组(P<0.01)，说明TP具有一定的清除热处理后猪睾丸间质细胞ROS的能力。

2.4 TP对Bax、Bcl-2、Cytc及Caspase-3的mRNA表达水平的影响

从图4可以看出，与空白组相比，热处理能够极显著降低抗凋亡基因Bcl-2相对表达量(图4A)，明显提高凋亡基因Bax相对表达量(图4B)与Bax/Bcl-2相对比值(图4C)，升高了Cytc的相对表达量(图4D)，并最终极显著提高凋亡执行基因Caspase-3相对表达量(图4E)。与热处理组相比，1 μg/mL TP热处理组能够极显著降低凋亡基因Bax、Cytc和Caspase-3的相对表达水平(P<0.01)，而抗凋亡基因Bcl-2相对表达量则被显著上调(P<0.05)。

2.5 TP对Cytc和Caspase-3浓度的影响

从图5可以看出，与空白组相比，热处理组细胞Cytc和Caspase-3浓度极显著升高(P<0.01)；与热处理组相比，1 μg/mL TP热处理组细胞Cytc和Caspase-3浓度极显著降低(P<0.01)。

图5 TP对细胞凋亡相关蛋白浓度的影响

2.6 TP对睾酮浓度的影响

从图6可以看出，与空白组相比，热处理组细胞睾酮分泌量明显降低；与热处理组相比，1 μg/mL TP热处理组内细胞睾酮分泌量极显著升高(P<0.01)。

图6 TP对睾酮浓度的影响

3 讨论

高温对所有的组织都有影响，但睾丸对温度更加敏感，环境温度高于阴囊正常范围极易使热敏感的生殖细胞死亡，并且会破坏细胞的功能，因此高温极易引起睾丸热应激从而导致雄性不育[14]。Hsp70是机体为抵御热应激而激活的必需因子，研究发现小鼠睾丸热应激后不久Hsp70表达上调[15]。在本试验中发现相似结果，高温热处理后，Hsp70浓度极显著升高，而加入TP的细胞Hsp70浓度下降明显，这可能是由于睾丸间质细胞在该温度下受到了热刺激，从而激活了Hsp70 表达抵御压力，而茶多酚的处理可能增强了细胞的耐受力，因而Hsp70表达下调。

热诱导ROS的产生损伤细胞内部结构，并引起细胞毒性作用[16]。有研究发现，ROS是热应激诱导细胞凋亡的关键介质[17]。ROS在细胞内积累一定数量，会激活细胞线粒体凋亡通路，使Cytc释放，通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡[18]。Bcl-2蛋白家族也参与线粒体凋亡途径，抗凋亡因子Bcl-2能与促凋亡因子Bax结合抑制细胞凋亡，并且Bax/Bcl-2比率变化是决定细胞是否存活的关键因素[19]。有研究表明，热应激通过下调Bcl-2蛋白，上调Bax和Bax/Bcl-2蛋白表达比例以及上调Caspase-3诱导睾丸间质细胞凋亡[20]。有学者证实，TP富含酚羟基，且含有相同的主要结构α-苯基苯丙吡喃，能与有害自由基反应生成具有一定稳定性的含有邻苯二酚结构的自由基来减少ROS生成量[21]。已有研究发现，TP能降低实验性精索静脉曲张致大鼠睾丸生精细胞凋亡和草甘膦致小鼠睾丸支持细胞的凋亡[22-23]。在本试验中发现相似结果，与热处理组相比，高热处理睾丸间质细胞中加入1 μg/mL TP能够显著提高细胞存活率，降低ROS水平，升高Bcl-2的mRNA表达水平，降低Cytc和Caspase-3的mRNA表达水平和蛋白浓度，降低Bax的mRNA表达水平和Bax/Bcl-2相对比值，这说明TP可通过清除细胞产生的过量ROS从而增强抗凋亡基因Bcl-2的表达，以及抑制凋亡相关基因Cytc、Bax和Caspase-3的过表达，从而提高细胞的存活率，因此TP对高热下猪睾丸间质细胞起到一定的凋亡保护作用。

此外，有研究报道，阴囊高温损害了大鼠睾丸间质细胞，降低了睾酮合成[24]。TP对雄性生殖有益处已有研究证实。TP中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)能缓解重金属铅对大鼠睾丸的毒性，提高睾酮水平[25]。本试验与以上结果一致，高温热处理降低了睾酮的分泌，加入TP预处理后对于高温下睾丸间质细胞能够明显升高睾酮分泌量，这可能与TP对凋亡途径的抑制作用进而提高了细胞存活率使得分泌睾酮的睾丸间质细胞增多有关，以上表明TP有一定雄性生殖保护作用。

4 小结

TP对高温下猪睾丸间质细胞具有保护作用，主要通过减少ROS的产生，降低细胞的凋亡，并能够一定程度上恢复细胞的睾酮分泌功能，且TP浓度在1 μg·mL-1效果最好，这为高温天气下TP预防种公猪睾丸热应激提供参考依据。