基于网络药理学研究灵芝治疗骨质疏松症的分子机制

冯平，李晓峰，霍乐乐

河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院），郑州 450016

近年来，骨质疏松症已成为老年人群和绝经后妇女的重要公共卫生问题之一。骨质疏松症会增加骨折风险，因而在世界范围内越来越受到重视［1-2］。随着老龄化进程的加快，我国骨质疏松症、骨质疏松性骨折的发生率逐年上升。据报道，2016年我国60岁以上人群骨质疏松症的患病率为36%，估计到2050年将有599万以上的老年人出现骨质疏松性骨折，给全社会带来巨大的经济压力和医疗负担［3-4］。因此，迫切需要开发有效的治疗策略来干预和治疗骨质疏松症。

中医药是中华民族的瑰宝，多味中药已被证实在治疗骨质疏松症、骨折、类风湿性关节炎等多种骨科相关疾病时具有疗效较佳、不良反应较少的优点［5-7］。也有大量的研究表明，有些中药能够通过改善肠道对钙离子的吸收、促进成骨细胞成熟、增强细胞的成骨活性以及抑制破骨细胞的形成来预防和治疗骨质疏松症［8-9］。因此积极寻找具有治疗骨质疏松症作用的中药并明确其有效成份是当前的研究热点之一。

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoder-masinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子实体，别名赤芝、木灵芝等，味甘，性平，归心、肺、肝、肾经，具有补气安神、止咳平喘的功效。目前已从灵芝中分离并鉴定出灵芝多糖、灵芝酮三醇等400多种化合物。现代药理学研究表明，灵芝具有免疫调节、降血糖、抗氧化、抗衰老等多种生物学活性［10］。《神农本草经》记载其“利关节，保神，益精气，坚筋骨……久食轻身不老，延年神仙”［11］，提示其在骨质疏松症等衰老性疾病的治疗中有巨大潜力。然而灵芝的药效物质基础尚不明确，其抗骨质疏松作用的靶点及机制也有待深入研究，这在一定程度上限制了其在临床上的推广和应用。

网络药理学是在经典药理学、计算机技术和生物信息学等多学科交叉融合的基础上发展起来的一门新兴学科，它可以从多个方面系统地研究药物与人体之间的相互作用及规律。网络药理学有助于探索药物发挥疗效的多种作用途径和（或）信号通路，该策略已被广泛应用于中医药多成份、多靶点、多路径、多功能研究及中药配方分析、新药开发等领域［7］。基于此，本研究通过运用网络药理学方法系统地探讨了灵芝治疗骨质疏松症的生物学机制，以期为临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 收集、筛选灵芝的活性成份及作用靶点

利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/molecule.php?qn=7088），基于吸收、分布、代谢及排泄等药代动力学参数，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药 物 相 似 性（drug-likeness，DL）≥0.18为限定条件筛选得到灵芝中的潜在活性成份。将获得的活性成份输入PubChem数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到其相应的分子结构，并保存为SMILES格式。为了确定灵芝的潜在靶标，将筛选得到的活性成份的SMILES文件逐一输入Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），限定物种为“homo sapiens”，通过整合去重后得到灵芝主要活性成份的预测靶点。应用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）对预测的靶点进行人类基因名转换。

1.2 骨质疏松症相关靶点的筛选

以“osteoporosis”为关键检索词，在DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/）和OMIM数据库（https：//omim.org/）中检索并筛选骨质疏松症已知的疾病靶点，整合两个数据库的检索结果并删除重复靶点，得到已知的与骨质疏松症密切相关的疾病靶点。

1.3 构建“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络

将灵芝活性成份与骨质疏松症的潜在作用靶点导入Cytoscape 3.2.1软件并构建“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”可视化网络。

1.4 构建蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）

通过Bioinformatics and Evolutionary Genomics在线网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将灵芝主要活性成份的潜在作用靶点与骨质疏松症已知靶点进行映射取交集，提取共同的靶基因。将共同的靶基因上传到String数据库（https：//string-db.org/），物种选择“homo sapiens”，获取蛋白质相互作用信息，并将结果导入Cytoscape 3.2.1 软件，构建PPI并进行可视化展示，同时对网络结构进行拓扑分析。

1.5 灵芝治疗骨质疏松症关键靶点通路与功能富集分析

将灵芝中活性成份和骨质疏松症共同靶点作为关键靶点，通过David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物种为“homo sapiens”，对关键靶点进行基因本体（gene ontology，GO）分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，得到共同靶点富集最具显著性的生物学注释。其中，GO分析包括生物过程、细胞组分和分子功能，以P＜0.01为筛选标准；KEGG分析以P＜0.05为筛选标准。

2 结果

2.1 灵芝活性成份及其作用靶点

通过TCMSP数据库共检索到灵芝中的242种化学成份，经筛选后得到61种灵芝活性成份。利用Swiss Target Prediction数据库预测灵芝中所有活性成份的作用靶点，去除无效和重复靶点后，61种活性成份共涉及107个作用靶点。

2.2 灵芝治疗骨质疏松症的潜在作用靶点

通过检索、合并、去重后共获得478个骨质疏松症相关靶点，将其与灵芝活性成份作用靶点相映射并绘制Venn图（图1），获得21个共同靶基因，包 括NR3C1、AR、HSD11B1、PGR、NOS3、CYP19A1、TACR3、CYP17A1、LDLR、ESR1、ESR2、CNR1、CNR2、VDR、HIF1A、NR1I2、MMP1、PTPN11、GC、MAPK1、MAPK3。

图1 灵芝活性成份作用靶点与骨质疏松症相关靶点的交集

2.3 “灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络

将灵芝治疗骨质疏松症的活性成份及作用靶点导入Cytoscape 3.2.1软件，得到“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络（图2）。结果表明，β-谷甾醇（beta-sitosterol）、环氧灵芝醇B （epoxyganoderiol B）、环氧灵芝醇C（epoxyganoderiol C）、麦角甾-4,7，22-三 烯-3，6-二 酮（ergosta-4,7,22-trien-3,6-dione）、灵芝酮三醇（ganodermatriol）、灵芝醇A（ganodermenonol）、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B能与6个以上的靶点相连接，是灵芝治疗骨质疏松症时的主要活性成份。

图2 “灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络

2.4 灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白

将灵芝与骨质疏松症映射得到的21个共同靶基因导入String数据库并绘制灵芝-骨质疏松症的PPI（图3）。在PPI中，去除2个孤立蛋白节点后，共有21个节点通过126条边发生相互作用。通过分析拓扑结构，筛选得到MAPK3、MAPK1、NR3C1、ESR1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A等共19个灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白（表1）。

表1 灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白

图3 灵芝-骨质疏松症的PPI图

2.5 GO分析和KEGG分析

利用DAVID数据库对灵芝治疗骨质疏松症的21个共同靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。在GO分析中，选取富集程度最高的20个生物过程进行展示（图4），结果显示灵芝主要涉及核受体的活性（nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、类固醇结合（steroid binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、DNA结合转录激活剂活性（DNA-binding transcription activitor activity）、RNA特异性聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ-specific）等生物过程。

图4 灵芝活性成份关键靶点GO生物过程富集分析

在KEGG分析中，按照P值大小进行排序，选取富集程度最高的前20条信号通路展示（图5），结果显示靶基因主要富集在催乳素信号通路（prolactin signaling pathway）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、肾细胞癌（renal cell carcinoma）、乳腺癌（breast cancer）等信号通路。

图5 灵芝活性成份关键靶点的KEGG 代谢通路富集分析

3 讨论

骨质疏松症是一种全身性代谢性骨病，其特征在于骨密度降低和脆性骨折风险增加。随着人类寿命延长和老龄化进程加快，骨质疏松症已成为重要的健康问题之一［12］。目前临床上所使用的降钙素、双膦酸盐、雌激素等抗骨质疏松药物大多数通过抑制破骨细胞活性发挥作用［13］，长期应用抗骨质疏松药物会增加乳腺癌、前列腺癌的患病风险，并易导致下颌骨坏死等不良反应［14］。因此，从中医药中寻找能够有效预防和治疗骨质疏松症的提取物是一种新的治疗策略。

灵芝对免疫系统、神经系统、内分泌系统以及心血管系统等都具有调节作用［10］。近年来，不少研究提示灵芝具有抗骨质疏松的作用［15］，但灵芝活性成份复杂，其在体内多成份、多靶点、多途径的药理特征尚未得到深入研究。本研究利用系统和规范的生物信息学方法来挖掘多种数据库，整合和分析靶蛋白和化合物的信息，对阐明灵芝抗骨质疏松的作用靶点及分子机制具有重要意义。

在本研究中，基于网络药理学方法，通过药代动力学系统评估、PPI分析以及GO、KEGG分析，初步研究了灵芝治疗骨质疏松症的有效成份和潜在靶点。本研究共筛选得到61种活性成份、107个活性成份可能的作用靶点以及478个骨质疏松症相关靶点。“灵芝活性成份-骨质疏松症-共同靶点”网络分析显示β-谷甾醇、环氧灵芝醇B、环氧灵芝醇C、麦角甾-4，7，22-三烯-3，6-二酮、灵芝酮三醇、灵芝醇A、Lucialdehyde A、Lucialdehyde B等活性成份能协同作用于多个靶点，表明灵芝在治疗骨质疏松症过程中具有多成份、多靶点交互作用的特性。进一步对21个灵芝治疗骨质疏松症的共同靶基因进行PPI分析，结果表明MAPK3、MAPK1、ESR1、NR3C1、AR、CYP19A1、NOS3、HIF1A在交互网络中具有最高权重，提示其可能是灵芝治疗骨质疏松症的关键靶点蛋白。MAPK3、MAPK1基因编码的MAPK1和MAPK3属于蛋白激酶，是MAPK信号通路中的重要分支之一，在细胞增殖、分化中起重要作用。MAPK1/MAPK3与细胞分化及骨形成密切相关。MAPK1/MAPK3被磷酸化后能够调节成骨分化特异性转录因子 RUNX2及其下游OSX基因的表达，上调成骨分化标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达，促进成骨细胞的成熟及基质的矿化［16-17］。雌激素受体（estrogen receptor，ER）属于核受体超家族，主要存在于细胞核中，通过与雌激素结合而参与多种生理过程的调节。ESR1是ER的一个亚型，在皮质骨中高表达。全基因组关联研究表明，ESR1基因多态性与骨密度密切相关［18］。糖皮质激素由于具有良好的抗炎作用而被广泛用于自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗，然而长期过量应用糖皮质激素会抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡从而导致骨质疏松症。NR3C1能够编码糖皮质激素受体，直接影响RANKL启动子的活性及其转录调控，诱导成骨细胞凋亡，导致主要骨重塑途径RANK/RANKL/OPG轴的失衡，骨吸收增加［19］。KEGG通路富集分析表明，灵芝中的生物活性成份可以通过多种途径发挥抗骨质疏松作用，其核心靶点主要涉及通路包括催乳素信号通路、雌激素信号通路、肾细胞癌、乳腺癌等。雌激素主要通过与ER结合来发挥其功能和作用，雌激素信号通路通常在骨质疏松症中出现失调，绝经后女性会由于体内雌激素水平的下降而发生骨重建失衡、骨吸收增加［20］。

综上所述，本研究应用网络药理学筛选了灵芝中的活性成份及其潜在靶点，揭示了灵芝发挥抗骨质疏松作用的潜在机制可能是基于其对潜在靶点和通路的直接或间接调控，体现了灵芝多成份、多靶点、多途径的治疗特点。网络药理学为灵芝治疗骨质疏松症提供了新的思路和方向，但仍需相关体外的细胞功能实验、体内的骨质疏松模型实验进行验证。