冬凌草甲素逆转BEL-7402/5-FU 化疗耐药作用的体内研究

史国军 王永生 何国浓 叶兴涛 施 航 陈如儿

化疗是肝癌治疗的重要手段之一，化疗耐药是目前治疗最大障碍[1]。如何增加恶性肿瘤对化疗药物的敏感性，提高疗效是临床上的主要难题。体外实验发现，冬凌草甲素能影响细胞增殖、凋亡和细胞周期，干预Hippo 信号通路，而实现部分逆转肿瘤细胞化疗耐药的功能。然而冬凌草甲素作为细胞毒药物的协同剂所发挥的抗肿瘤作用，在体内是否同样有逆转化疗耐药的功能，笔者就此进行了进一步的研究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养 人肝癌细胞株BEL-7402，来源于中科院上海细胞库。

1.2 实验动物 4～6 周龄BALB/c 雌性裸小鼠40只，体质量14～16 g，由上海灵畅生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0003，质量合格证号：20180003022587，使用许可证号：SYXK（浙）2019-0010。在无特定病原体（SPF）条件下饲养。温度（22±2）℃，湿度50%～60%，12 h 昼夜节律饲养。本实验研究经浙江省中医药研究院实验动物福利伦理委员会审查通过，伦理审查批号：浙中研动物伦理审字第[2022]053 号。

1.3 试剂与药物 逆转录试剂盒（TaKaRa 公司，批号AK22355A）；Yes 相关蛋白（Yes-associatedprotein，YAP）、具有PDZ 结合域的转录共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，批号AK31128A）；全自动蛋白定量分析试剂盒（Protein Simple 公司，批号64505）；抗体均为兔来源，包括细胞周期蛋白D1抗体（CyclinDl），结缔组织生长因子抗体（connective tissue growth factor，CTGF）、生存素抗体（Survivin）、B 淋巴细胞瘤-2 抗体（Bcl-2）（杭州戴格生物技术有限公司，批号分别为Q0316、R1106、S0910、T0729）。冬凌草甲素（Oridonin，CAS：28957-04-2，批号A15A0287）（纯度≥99%），购于成都普思生物科技股份有限公司。氟尿嘧啶注射液（10 mL:0.25 g，上海旭东海普药业有限公司，批号FA201005）。

1.4 主要仪器 3111 型CO2培养箱（Thermo 公司）；Centrifuge 5810R 型离心机（Eppendorf 公司）；HR40-Ⅱ-A2 型医用净化工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；DFC 7000T 型倒置显微镜（德国Leica 公司）；Step One Plus 荧光定量PCR 仪（ABI 公司）；WES 全自动蛋白定量分析仪（美国Protein Simple 公司）。

1.5 人肝癌BEL-7402/5-FU 耐药细胞株的建立人肝癌BEL-7402 细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法，用含0.1 μmol/L 5-FU 的培养液，低浓度持续诱导3～5 d，弃上清，加入新鲜培养液培养，当细胞恢复生长后，加入含10 μmol/L 5-FU 的培养液进行大剂量冲击诱导，待存活细胞恢复增殖后，加入含1 μmol/L 5-FU 的培养液继续诱导，直至细胞能在该浓度下增殖。根据以上方法反复诱导，当细胞能在含50 μmol/L 5-FU 的培养液中存活时，即为人肝癌BEL-7402/5-FU 耐药细胞株。

1.6 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立 取对数生长期的BEL-7402/5-FU 细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/mL，接种至裸鼠右腋皮下，0.2 mL/只，共40 只。接种后5 d 开始观察成瘤情况，当肿瘤长至100 mm3时，按照随机数字表法分成八组，即模型组，冬凌草甲素高、中、低剂量组[分别为75、50、25 mg/（kg·d）]，5-FU 组，5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组，每组5 只。分组当天开始灌胃给药，冬凌草甲素高、中、低剂量组及合用组给予相应浓度冬凌草甲素溶液灌胃，模型组给予生理盐水灌胃，灌胃容积均为0.2 mL/10 g。5-FU 组及5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组给予5-FU 腹腔注射20 mg/（kg·d），每日1 次，连续5 d。每周测量1 次体质量，每隔3 d 分别用游标卡尺测量移植瘤最大长径（a）及横径（b），计算瘤体积，肿瘤体积V（mm3）=1/2ab2，并绘制肿瘤生长曲线。实验结束时完整剥取瘤体，称瘤重，计算抑瘤率（%），抑瘤率=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

1.7 实时荧光定量PCR 法检测各组肿瘤组织中YAP、TAZ 的mRNA 表达水平 取上述裸鼠部分肿瘤组织，液氮研磨，Trizol 法提取总RNA，按照试剂盒说明进行逆转录反应和Real-time PCR 检测。逆转录反应条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。PCR反应条件：95 ℃，30 s，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 个循环；熔解曲线95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s。YAP上游引物5'-CAGAACCGTTTCCCAGACTACCTTG-3'，下游引物5'-GCAGACTTGGCATCAGCTCCTC-3'；TAZ 上游引物5'-ATCACCAACACCAGCAGCAGATG-3'，下游引物5'-TGGATTCTCTGAAGCCGCAGTTTC-3'；内参EF-1α 上游引物5'-CGAGCCACCATACAGTCAGA-3'，下游引物5'-CCATTCCAACCAGAAATTGG-3'；采用相对定量分析方法（2-ΔΔCt法）进行分析。

1.8 Western blot 法检测各组肿瘤组织中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白表达水平 取上述裸鼠部分肿瘤组织，液氮研磨，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，按照WES 全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明，在反应板内依次加入蛋白样品3 μL/孔，抗体稀释液10 μL/孔，兔抗人CyclinDl 抗体、CTGF 抗体、Survivin 抗体、Bcl-2抗体（一抗，1∶20 稀释）10 μL/孔，兔抗人GAPDH 抗体（内参，1∶200 稀释）10 μL/孔，HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体（二抗）10 μL/孔，发光液15 μL/孔，清洗缓冲液500 μL/孔，用WES 全自动蛋白定量分析仪进行检测，并用Compass 软件进行峰面积（Peak area，PA）的分析，蛋白相对表达水平用PA目标蛋白/PA内参蛋白比值表示。

1.9 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s） 表示。多组间比较采用单因素方差分析法，两组间比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 冬凌草甲素对裸鼠移植瘤生长的影响 所有裸鼠均于接种后7 d 左右出现肉眼可见的瘤体，表现为接种部位出现皮下小结节，起初椭圆形，逐渐变不规则，成瘤率100%。肿瘤长至100 mm3左右时，即第2周开始分组给药。给药1 周后，与模型组比较，5-FU组的裸鼠体质量显著降低（P＜0.05）；冬凌草甲素高、低剂量组和5-FU+冬凌草甲素中剂量组体质量显著高于5-FU 组（P＜0.05）。给药结束后，5-FU 组和5-FU+冬凌草甲素高剂量组的体质量显著低于模型组（P＜0.01）；而冬凌草甲素高、中、低剂量组和5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的体质量均高于5-FU 组（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，给药各组的瘤重显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组相比，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的瘤重显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。各组的抑瘤率为25.18%～79.38%。见表1、2。

表1 各组裸鼠体质量变化（g，±s）

表1 各组裸鼠体质量变化（g，±s）

注：模型组予生理盐水灌胃；冬凌草甲素高、中、低剂量组予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低剂量组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与5-FU 组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别模型组冬凌草甲素高剂量组冬凌草甲素中剂量组冬凌草甲素低剂量组5-FU 组5-FU+冬凌草甲素高剂量组5-FU+冬凌草甲素中剂量组5-FU+冬凌草甲素低剂量组鼠数5 5 5 5 5 5 5 5第1 周15.68±1.46 15.28±1.07 15.24±0.63 15.76±0.70 15.80±0.80 15.22±0.79 15.90±1.16 16.02±1.10第2 周17.46±0.82 17.86±0.44 17.32±0.63 17.44±0.82 18.02±0.91 17.64±0.98 17.84±0.74 17.54±0.42第3 周18.46±1.16 17.74±0.89c 17.38±0.86 18.38±1.15c 16.64±1.57a 17.14±0.86 18.02±1.34c 17.16±0.78第4 周20.76±0.79 18.84±0.81d 19.28±0.57d 19.60±1.95c 15.32±1.36b 16.44±0.39bc 17.62±1.69d 16.72±2.08

表2 各组裸鼠瘤重与抑瘤率比较（±s）

表2 各组裸鼠瘤重与抑瘤率比较（±s）

注：模型组予生理盐水灌胃；冬凌草甲素高、中、低剂量组予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低剂量组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；“-”为无此项数据；与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与5-FU 组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别模型组冬凌草甲素高剂量组冬凌草甲素中剂量组冬凌草甲素低剂量组5-FU 组5-FU+冬凌草甲素高剂量组5-FU+冬凌草甲素中剂量组5-FU+冬凌草甲素低剂量组鼠数5 5 5 5 5 5 5 5瘤重（g）1.852±0.584 1.079±0.307bc 1.240±0.250bd 1.386±0.329ad 0.783±0.194b 0.382±0.214bd 0.603±0.204bc 0.897±0.317b抑瘤率（%）-41.75 35.41 25.18 57.72 79.38 67.45 51.57

与模型组比较，分组给药第1 天，各组瘤体积大小无显著差异。给药第5 天，与模型组比较，5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组的瘤体积显著缩小（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高剂量组瘤体积显著缩小（P＜0.05）。给药第9 天，与模型组比较，5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组，5-FU组，冬凌草甲素高、中剂量组瘤体积明显缩小（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组瘤体积显著缩小（P＜0.05，P＜0.01）。给药14 d 后，除冬凌草甲素低剂量组外，其余各组的瘤体积均明显小于模型组（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高剂量组瘤体积显著缩小（P＜0.01）。见图1。

图1 裸鼠移植瘤生长曲线

2.2 冬凌草甲素对裸鼠移植瘤组织YAP、TAZ mRNA表达的影响 与模型组比较，5-FU 组和5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组的YAP mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，冬凌草甲素高剂量组，5-FU 组，5-FU+冬凌草甲素高、中、低剂量组的TAZ mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高剂量组的TAZ mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组瘤组织中YAP、TAZ 的mRNA 相对表达量（±s）

表3 各组瘤组织中YAP、TAZ 的mRNA 相对表达量（±s）

注：模型组予生理盐水灌胃；冬凌草甲素高、中、低剂量组予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低剂量组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；YAP 为Yes 相关蛋白；TAZ 为具有PDZ 结合域的转录共刺激因子；与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与5-FU 组比较，cP＜0.05

组别模型组冬凌草甲素高剂量组冬凌草甲素中剂量组冬凌草甲素低剂量组5-FU 组5-FU+冬凌草甲素高剂量组5-FU+冬凌草甲素中剂量组5-FU+冬凌草甲素低剂量组鼠数5 5 5 5 5 5 5 5 YAP 1.003±0.093 0.914±0.269 0.889±0.266 0.873±0.287 0.319±0.142a 0.242±0.120a 0.231±0.114a 0.267±0.053b TAZ 1.003±0.096 0.649±0.253a 0.847±0.109 0.912±0.229 0.542±0.222b 0.225±0.114bc 0.416±0.185b 0.446±0.147b

2.3 冬凌草甲素对裸鼠移植瘤组织CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白表达的影响 与模型组比较，冬凌草甲素中剂量组，5-FU 组，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的CyclinDl 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，各给药组的CTGF 蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.01）；与5-FU 组相比，冬凌草甲素高剂量组，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的CTGF 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，冬凌草甲素高、中剂量组，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的Survivin 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高剂量组的Survivin 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，冬凌草甲素高、中剂量组，5-FU 组，5-FU+冬凌草甲素高、中剂量组的Bcl-2 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与5-FU 组比较，5-FU+冬凌草甲素高剂量组的Bcl-2 蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01）。见图2 和表4。

图2 各组瘤组织中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相对表达量

表4 各组瘤组织中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组瘤组织中CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 的蛋白相对表达量比较（±s）

注：模型组予生理盐水灌胃；冬凌草甲素高、中、低剂量组予75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素溶液灌胃；5-Fu 组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射；5-Fu+冬凌草甲素高、中、低剂量组予20 mg/（kg·d）5-Fu 腹腔注射+75、50、25 mg/（kg·d）冬凌草甲素灌胃；CyclinDl 为细胞周期蛋白D1；CTGF为结缔组织生长因子；Survivin 为生存素；Bcl-2 为B 淋巴细胞瘤-2；与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与5-FU 组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别模型组冬凌草甲素高剂量组冬凌草甲素中剂量组冬凌草甲素低剂量组5-FU 组5-FU+冬凌草甲素高剂量组5-FU+冬凌草甲素中剂量组5-FU+冬凌草甲素低剂量组鼠数5 5 5 5 5 5 5 5 CyclinDl 0.445±0.087 0.360±0.071 0.333±0.050a 0.357±0.056 0.327±0.069a 0.284±0.033b 0.336±0.053a 0.356±0.034 CTGF 0.171±0.025 0.045±0.010bd 0.089±0.007b 0.103±0.023b 0.095±0.008b 0.041±0.013bd 0.049±0.007bd 0.100±0.019b Survivin 0.386±0.060 0.297±0.065a 0.293±0.062a 0.352±0.062 0.309±0.031 0.185±0.056bd 0.289±0.026a 0.298±0.025 Bcl-2 0.472±0.049 0.281±0.036b 0.356±0.053a 0.412±0.088 0.375±0.033a 0.175±0.034bd 0.374±0.057a 0.394±0.071

3 讨 论

肝癌的治疗耐药和Hippo 信号通路失调密切相关。Hippo 信号通路中主要效应分子YAP/TAZ 属于癌基因[2]。Hippo 信号通路的核心作用是失活主要效应分子YAP/TAZ，阻断增殖相关基因CylinDl、CTGF以及凋亡抑制基因Survivin、Bcl-2 的表达[3]。中药作为防治肿瘤的重要组成部分，在辅助化疗药物增强功效、减轻副作用、降低耐药性方面具有其独特的优势[4]。课题组前期研究发现，冬凌草甲素能抑制人肝癌SMMC-7721 细胞增殖，诱导细胞凋亡、抑制其迁移能力，这与其抑制Wnt/β-catenin 信号通路，上调E-cad 蛋白、降低Vimentin 蛋白表达有关[5-6]。本项目前期体外实验研究发现，冬凌草甲素可逆转肿瘤细胞化疗耐药，影响细胞增殖、凋亡和细胞周期，其机制可能与干预Hippo 信号通路有关。

本研究发现，冬凌草甲素能抑制耐药细胞株BEL-7402/5-FU 裸鼠移植瘤的生长，与5-Fu 合用高剂量组的抑瘤率最为明显。与模型组比较，5-FU 组及其合用高、中、低剂量组的YAP 和TAZ mRNA 相对表达量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而合用高剂量组的TAZ mRNA 相对表达量降低最为明显（P＜0.01）。Western blot 结果显示，各组肿瘤组织的CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05，P＜0.01），而合用高剂量组的蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01）。

综上所述，本研究结果显示，冬凌草甲素可抑制各组耐药细胞株BEL-7402/5-FU 裸鼠移植瘤的生长，降低YAP 和TAZ mRNA 的表达，降低肿瘤组织的CyclinDl、CTGF、Survivin、Bcl-2 蛋白的表达，其机制可能与干预Hippo 信号通路有关。冬凌草甲素可能作为一种新的肝癌耐药逆转剂，具有一定的临床应用价值。