清热凉血方治疗寻常型银屑病血热证的临床疗效观察及对外周血miR-31 表达的影响

王锦慧 曹 毅 陶茂灿 马丽俐 杨晓红

银屑病是一种以皮损部位表皮过度增殖和毛细血管过度增生为特征的红斑鳞屑性皮肤病[1]，属中医学“白疕”范畴，历代医家多从血热、血瘀、血虚论治，目前基本形成了“辨血为主、从血论治”的基本思路和经典理论体系，以“理血”为治疗总纲[2-3]。其中血热证被认为是本病的重要起始环节和疾病转化的关键期[4-6]。本研究拟通过观察清热凉血方治疗寻常型银屑病血热证皮肤镜下血管球扩张直径及外周血miR-31 表达的变化，探讨清热凉血类中药治疗银屑病的可能作用机制。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2021 年5 月至2022 年2 月就诊于浙江中医药大学附属第一医院皮肤科的寻常型银屑病患者60 例。按照计算机产生的随机号随机分为治疗组和对照组，各30 例。另外采集与入选样本治疗组患者性别、年龄匹配的健康人群血标本，标本来源于本院体检中心健康人群。本项目经过医院医学伦理委员会审查通过（伦理审批号：2021-KL-116-01）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《中国临床皮肤病学》[7]、《中国银屑病诊疗指南（2018 版）》[8]中的诊断标准：符合寻常型银屑病的临床表现，包括点滴状银屑病和斑块状银屑病。皮损为不同形态、境界清晰的红色丘疹、斑丘疹或斑块，覆以多层紧密附着鳞屑，可伴有薄膜现象、Auspitz 征、蜡滴现象、同形反应及束状发、顶针状甲。

1.2.2 中医诊断标准 参照《中国银屑病诊疗指南（2018 版）》[8]、《寻常型银屑病（白疕）中医药循证临床实践指南（2013 版）》[3]中血热证辨证标准。（1）主症：多见于银屑病进行期，皮损发展较快，新出皮疹不断扩大、增多，皮损呈鲜红色，血露现象明显，鳞屑干燥而厚，瘙痒较甚；（2）次症：心烦、口渴、小便色黄、大便干，舌质红绛，苔黄，脉弦滑或数。具备主症及2 项以上的次症即可判定为血热证。

1.3 纳入标准 （1）符合上述西医寻常型银屑病诊断标准及中医血热证辨证标准；（2）年龄18～80 周岁，病程超过6 个月以上；（3）近1 个月未使用系统或局部银屑病药物治疗；（4）签署知情同意书，自愿入选本次研究。

1.4 排除标准 （1）合并有严重的肝肾、心脑血管及造血系统疾病；（2）慢性严重感染、精神病、糖尿病、吸烟、酗酒者；（3）近1 个月内有免疫抑制用药史的患者；（4）备孕、妊娠或哺乳期妇女；（5）过敏体质或对治疗方案中所含药物过敏的患者。

1.5 剔除标准 （1）治疗中途不遵医嘱用药或自行使用其他药物及观察资料不全者；（2）治疗依从性差，未能完成治疗疗程。

1.6 脱落标准 （1）治疗过程中出现影响观察的其他系统疾病；（2）治疗过程中合并或转为脓疱型、红皮病型等其他型患者。

2 方 法

2.1 治疗方法 对照组：外用糠酸莫米松乳膏[拜耳医药上海有限公司，批号H19991418，规格：0.1%（5 g∶5 mg）]卡泊三醇软膏（LEO Laboratories Limited，批号HJ20160069，规格：30 g∶1.5 mg）。治疗组：外用药同治疗组，另予中药清热凉血方口服（中药组成：水牛角、土茯苓各30 g，紫草、生地黄各20 g，大青叶15 g，丹皮、槐花、黄芩、制大黄、露蜂房、郁金各10 g）。所有中药颗粒来自浙江中医药大学附属第一医院中药房，将上述剂量颗粒剂250 mL 沸水中，搅拌均匀后充分溶解，每日1 剂，早晚分服。女性患者在经期前3 d 停服，避免性味寒凉中药影响月经。连续治疗2 周为1 个疗程，共4 个疗程，2 周观察随访1 次。

2.2 观察指标

2.2.1 临床各项积分 （1）银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分[8]：将人体分为头颈、上肢、躯干、下肢四部分，计算皮损面积分，各部分鳞屑（D）、红斑（E）、和浸润（I）的严重程度分，乘以各自系数，最后将四部分得分相加，即为PASI 总分，总分分值0～72 分。（2）瘙痒程度评分[8]：总分分值0～10 分，分为五个等级。（3）皮肤病生活质量指数（DLQI）评分[8]：包括患者症状、心理活动、工作状态、日常行为以及娱乐休闲五个方面，分值范围0～30 分。（4）中医证候评分[3，9]：中医证候的分级量化评分，主症包括皮疹色深红、剧烈瘙痒2 项，次症包括口干、心烦易怒、小便深黄、大便便秘，舌红、苔黄厚，脉弦滑数6 项。各症根据无、轻度、中度、重度分别计0、2、4、6 分，分值0～48 分，评分越高，血热证越明显。各项评分由本院两位主治以上皮肤科医师进行，取两者平均值。

2.2.2 皮肤镜下血管球扩张直径 拍摄入组患者典型皮损的镜下图像（高倍、低倍）。打开Image-Pro Plus（Version 6.0，Media Cybernetics）软件处理靶部位皮损图像：在高倍图像下，按照垂直、水平分割法，按照“井”字将视野均分为上下三等份，形成九宫格模式。任意选取四格，取每张等分图像中最大的血管球，分点多次测量血管管腔扩张直径，分别测量选取的血管球长轴及短轴，取其长度平均值。

2.2.3 外周血miR-31 表达的检测

2.2.3.1 主要试剂及仪器 QPCR 仪（杭州博日FQD-96A）、PCR 仪（郎基A300）、QPCR 酶[TSE202，2xT5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I），擎科]、逆转录酶[Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix（TSK314S），擎科]等。

2.2.3.2 总RNA 的提取、cDNA 的制备及PCR 扩增外周血血清提取总RNA 参照擎科动物组织/细胞总RNA 提取试剂盒说明书进行，严格无酶操作，提完后测各组RNA 浓度后分装，-80 ℃保存待用。miR-31 c DNA 严格按擎科逆转录试剂盒Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix。反转录反应体系包括：RNA template 5μL，gDNA remover 1 μL，10XgDNA remover Buffer 1 μL，RNase-free water up to 10 μ，42 ℃2 min，60 ℃ 5 min 后加入Rnasin 1 μL，Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix 4 μL，RNase-free water up to 20 μL，总反应体系20 μL，逆转录条件：25 ℃10 min，50 ℃30 min，85 ℃5 min。逆转录完成后立即放冰上冷却。反转录得到的cDNA 产物3 倍稀释后作为qPCR 模板，以擎科2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）进行扩增进行相应PCR 扩增操作。Real-time PCR 在ABI 7900 HT 高通道荧光定量PCR 仪上进行，每个样本重复5 次。反应条件：第1步：预变性95 ℃2 min；第2 步：PCR 反应，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s 重复40 次；第3 步：熔解。采用2-ΔΔCt表达量法计算miR-31 的相对表达量。

2.3 疗效判定[9]疗效计算公式：（治疗前评分-治疗后评分）/治疗前评分×100%。疗效判定标准：痊愈：PASI 评分减少95%以上；显效：PASI 评分减少60%～94%；有效：PASI 评分减少25%～59%；无效：PASI 评分减少＜25%。总有效率=（临床痊愈率+显效率）/该组总病例数×100%。

2.4 统计学方法 应用IBM SPSS Statistics 22.0 软件进行数据管理和统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s） 表示，采用两独立样本t 检验进行两组间比较，偏态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）[M（P25，P75）]表示，采用两独立样本非参数检验进行两组间比较。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，相关性分析采用Pearson 相关性检验，重复测量方差分析比较各指标的纵向变化趋势。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 两组寻常型银屑病患者一般资料比较 本次研究共纳入患者60 例，部分患者因病情加重，合并使用生物制剂或其他免疫抑制剂治疗及其他原因未能完成治疗疗程，剔除共6 例；最终完成研究患者54例。治疗组男16 例、女12 例，年龄（46.29±15.95）岁，病程（8.39±7.64）个月；对照组男16 例、女10 例，年龄（45.62±15.83）岁，病程（8.23±5.30 个月）。两组患者性别、年龄、病程比较，差异无统计学意义（P＞0.05），均具可比性。

3.2 两组寻常型银屑病患者临床各项评分比较 两组患者治疗前临床各项评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后临床各项评分均有一定程度降低（P＜0.05），且治疗组患者治疗后各项评分均低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组寻常型银屑病患者临床各项评分比较（分，±s）

表1 两组寻常型银屑病患者临床各项评分比较（分，±s）

注：对照组予常规治疗；治疗组在常规治疗基础上予中药清热凉血汤口服治疗；PASI 为银屑病皮损面积和严重程度指数；DLQI 为皮肤病生活质量指数；与本组治疗前比较，aP＜0.05；与对照组同期比较，bP＜0.05

组别对照组治疗组t 值P 值例数26 28 PASI 评分瘙痒评分DLQI 评分中医证候评分治疗前9.81±4.04 10.04±4.28 0.201 0.841治疗后6.30±3.47a 4.54±2.53ab-7.263＜0.001治疗前4.04±1.51 4.25±1.46 0.524 0.602治疗后2.96±1.54a 2.54±1.55ab-5.490＜0.001治疗前9.15±2.62 9.32±3.20 0.457 0.650治疗后6.58±3.09a 4.93±2.88ab-6.207＜0.001治疗前20.77±3.84 20.21±4.97 0.210 0.835治疗后15.15±4.81a 7.93±2.52ab-13.725＜0.001

3.3 两组寻常型银屑病患者皮肤镜下血管球直径比较及其与临床评分相关性 对治疗前、治疗后4 周、治疗后8 周两组患者的皮肤镜下血管球直径进行重复测量方差分析，皮肤镜下血管球直径的时间效应、组间效应、交互效应均具有统计学意义（P＜0.01），见表2。治疗后PASI 评分相对指数与血管球直径相对指数呈正相关性（r=0.851，P＜0.001）。治疗后中医证候评分相对指数与血管球直径相对指数呈正相关性（r=0.420，P=0.002）。见图1。

图1 寻常型银屑病患者血管球直径相对指数与PASI 评分、中医证候评分相对指数相关关系

表2 两组寻常型银屑病患者皮肤镜下血管球直径比较（μm，±s）

表2 两组寻常型银屑病患者皮肤镜下血管球直径比较（μm，±s）

注：对照组予常规治疗；治疗组在常规治疗基础上予中药清热凉血汤口服治疗

组别治疗组对照组皮肤镜下血管球直径组间效应交互效应例数时间效应26 28治疗前81.29±11.50 80.88±14.80治疗后4 周44.57±13.81 59.04±13.02治疗后8 周33.32±17.14 49.96±19.64 F 值180.615 P 值＜0.001 F 值9.583 P 值0.003 F 值9.262 P 值0.001

3.4 外周血miR-31 表达水平比较 比较治疗组患者治疗前与健康对照人群血清miR-31 表达水平，健康对照组低于银屑病治疗组患者[（1.42±0.58）比（2.98±1.92），P＜0.05]。比较治疗组患者治疗前后血清miR-31-5p 表达水平，治疗组患者治疗后低于治疗前[（1.26±1.04）比（2.98±1.92），P＜0.05]。

3.5 两组寻常型银屑病患者总体疗效比较 治疗组治疗后总有效率82.14%（23/28），其中有效10 例（35.71%），显效13 例（46.43%），无效5 例（17.86%）；对照组治疗后总有效率53.85%（14/26），其中有效9例（34.62%），显效5 例（19.23%），无效12 例（46.15%）。两组整体疗效比较差异有统计学意义（Z=5.004，P=0.025）。

4 讨 论

目前认为炎症反应和血管增生是银屑病的发病基础[10-11]。血管增生被视为银屑病的启动因素，银屑病的初始变化伴随着促血管生成因子和抗血管生成因子的失平衡状态以及真皮乳头血清因子引起的血管扩张[12]。微血管的异常增生是银屑病的发生发展、持续、复发的一个重要环节，血管扩张、增殖为过度增殖的角质形成细胞提供营养，促进炎症细胞迁移，对银屑病病情进展至关重要[13-15]。

清热凉血方以《备急千金要方》中犀角地黄汤化裁为基础方药，方中以水牛角、生地为君，清营分之血热，解营分之热毒，生地协水牛角凉血养阴，防清凉苦寒之药伤阴化燥。丹皮凉血祛瘀生新，防止热瘀互结，凉血而不散血，清中有养。再加甘咸性寒之紫草，咸可入血，寒则清热，功善凉血活血解毒、透疹消斑。大黄、黄芩凉血兼顾清血分之血热毒邪。槐花、郁金入肝经，苦寒沉降，清肝经之郁热，泄血分之郁遏。方中大青叶、土茯苓增清热解毒之功；本病属顽癣固疾，在草木之品之上，再伍露蜂房搜风通络止痒。全方直切病机，围绕血热、从血论治，精巧配伍，共奏清热解毒、凉血活血消斑之效，使热清血宁、斑疹透消。基础实验证实，清热凉血方通过多种生物学机制发挥效应，可能通过抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、Janus 激酶/信号转导及转录因子（JAKs/STATs）等信号通路，减少肿瘤坏死因子（TNFα）、γ 干扰素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）的分泌，抑制银屑病角质形成细胞过度增殖、表皮过度角化，从而影响银屑病的发生发展进程[17-18]。

利用皮肤镜在镜下对银屑病患者靶部位皮损的血管扩张直径进行评价，可以做到评价指标的进一步客观量化，运用皮肤镜评价寻常型银屑病临床疗效及微循环改变是一个新的切入点。本研究患者血管球直径相对指数与PASI 评分相对指数呈高度相关，银屑病靶部位皮损恢复程度与皮肤镜下血管球直径趋向正常水平呈正性线性相关。随着清热凉血方联合糠酸莫米松乳膏、卡泊三醇软膏的治疗，皮损逐渐消退，血管球直径逐渐回归正常值，两者变化呈高度一致。说明清热凉血方可能通过改善银屑病患者的局部血管扩张和增生，进一步对银屑病皮损起治疗作用。

miR-31 因其具有较为明显的表达改变和生物学活性而受到关注，在银屑病皮损和外周血中miR-31 表达明显升高[19]。本研究结果显示，外周血miR-31 相对表达量与银屑病患者皮损严重程度的变化趋于一致，银屑病患者红斑变淡、浸润减轻、鳞屑减少等症状的好转，可能伴随着外周血miR-31 表达量的降低。我们基于此推测外周血miR-31 与银屑病皮损毛细血管增生扩张有关，清热凉血方治疗血热证银屑病的机理之一可能是通过调控miRNA 基因的表达，抑制外周血miR-31 水平，使miR-31 基因的异常表达趋向正常，使受miR-31 调控的编码蛋白的mRNA 表达趋于正常，从而纠正血热证银屑病患者的中医证型，达到减少皮损部位新生血管生成而改善临床症状的治疗作用。