柽柳丛枝植原体鉴定及16S rRNA基因多样性分析

李 丰,赖刚刚,2,赵志惠,陈小飞,朱天生

(1.塔里木大学农学院/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室/农业农村部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站,新疆阿拉尔 843300;2 新疆生产建设兵团第四师农业科学研究所,新疆可克达拉 835219)

0 引 言

【研究意义】柽柳(Salt cedar)(TamarixchinensisLour.)为柽柳科、柽柳属植物,具有耐盐碱、耐高温寒冷的特性,能适应干旱沙漠和在滨海盐土生存,是南疆地区防风固沙、改造盐碱地、绿化环境的优良树种之一[1]。植原体(Phytoplasma)属软壁菌门(Tenericutes)柔膜菌纲(Mollicutes),Doi等[2]在发病的植物筛管中发现,是一类没有细胞壁的原核生物,主要寄生在植物韧皮部组织中,其传播方式主要是依靠介体昆虫(刺吸式口器叶蝉、飞虱等)进行传播,也可靠菟丝子和嫁接的方式传播[3]。早期植原体的分类依据主要是根据寄主植物感病后所表现出来的症状、寄主的范围、介体昆虫等进行分类。【前人研究进展】目前,植原体的分类主要还是依据16S rRNA、rp、secY等保守基因序列和基因组的差异进行[4],组和亚组的划分主要是依据16S rRNA基因序列的RFLP分析图谱的相似系数[5]。植原体已鉴定划分为52个暂定种、36个组和100多个亚组[6]。植原体没有细胞壁,因此当受到外力作用时形态很容易发生变化,就会呈现出各种不同的形态,如球形、椭圆形、长杆形和不规则形等[7]。Zhao等[8]在中国西安郊区发现了表现出异常症状的柽柳,将其命名为柽柳丛枝病(Salt cedar witches’-broom.SCWB),该症状可能是由植原体引起的,经过RFLP和16S rRNA基因全长克隆序列分析也证实:病株植物均属于植原体病害,并将其划分至16S rXXX组(Salt cedar witches’-broom phytoplasma group,柽柳丛枝植原体组),并确定一个新候选种‘CaPhtamaricis’,SCWB1被指定为16SrXXX-A亚组的代表菌株[9]。【本研究切入点】新疆关于植原体病害的报道多集中在16SrV组,如枣疯病[10]、柳树花变叶植原体[11]、杏褪绿卷叶植原体[12]等。柽柳丛枝植原体16S rRNA基因在南疆各地区存在差异,其影响因素较多,病原物本身的变异、生长环境的差异、地理位置以及气候的不同、不同的地区存在的传播介体等都可能使16S rRNA基因在不同地区形成多样性。关于16SrXXX组植原体病害及rp基因的PCR扩增,未见详细的报道。需对SCWB在南疆地区的分布及发生情况、形态学、分子生物学角度对SCWB植原体进行研究。【拟解决的关键问题】以新疆南疆地区柽柳丛枝病为材料,调查该病害在新疆南疆地区的分布及危害情况,运用形态学和分子生物学的手段对该病害病原物做出鉴定,研究该病原物的形态特征及其分类地位,分析其16S rRNA基因的多样性,为该病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

收集表现出丛枝症状的柽柳样品及正常的柽柳样品(采自新疆南疆各地区),PCR产物回收试剂盒、标准分子量Marker及克隆载体pMD18-T等分子生物学试剂产品购自TaKaRa公司,2.5%的戊二醛及电镜观察相关药品购自上海生工。

1.2 方 法

1.2.1 柽柳丛枝病的分布及危害调查

2020年及2021年在新疆南疆随机采样调查地区4个市、5个县和2个团场柽柳丛枝病的发生及分布情况。参照董绪曾[13]病害分级标准,制定柽柳丛枝病分级标准。表1

表1 柽柳丛枝病病情指数分级标准

1.2.2 柽柳丛枝病病原菌形态学鉴定

利用透射电子显微镜对柽柳丛枝病病原菌形态学进行观察,步骤参考李正男[13]。

1.2.3 柽柳丛枝病分子鉴定

1.2.3.1 样品DNA提取

分别取表现出丛枝症状的柽柳及正常的柽柳韧皮部组织,植物总DNA的提取采用漆艳香等[14]的CTAB法,0.8%琼脂糖电泳检测DNA样品完整性,合格样品置于-20℃备用。

1.2.3.2 柽柳丛枝植原体PCR扩增

(1)柽柳丛枝植原体16S rRNA基因PCR扩增

以提取的植物总DNA为模板,利用Lee等[15]和Gundersen等[16]设计的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mR1(CATGCAAGTCGAACGGA/CTTACCCCCAATCATCGA)进行直接PCR扩增。反应体系为:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,引物R16mF2和R16mR1各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。扩增条件为:94℃ 3 min; 94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 2 min,35 cycles;72℃ 10 min。将直接PCR产物稀释20倍后作为巢式PCR的模板,用引物对R16F2n/R16R2(GAAACGACTGCTAAGACTGG/TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG)进行巢式PCR扩增。反应体系为:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,R16F2n和R16R2各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。扩增条件为:94℃ 3 min;94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 2 min,35cycles;72℃延伸10 min。

(2)柽柳丛枝植原体rp基因PCR扩增

直接以提取的植物总DNA为模板,利用引物对rpF1/rpR1(TCGCGGTCATGCAAAAGGCG/ACGATATTTAGTTCTTTTTGG)进行直接PCR扩增。反应体系为:2×SanTaqPCR Mix 12.5μL,引物rpF1和rpR1各1μL,DNA模板1μL,加ddH2O至25μL。扩增条件为:95℃ 3 min;95℃ 15s,51℃ 30s,72℃ 90s,35 cycles;72℃ 10 min。将直接PCR产物稀释20倍后作为巢式PCR的模板,用引物对rp(I)F1/rp(I)R1(TTTTCCCCTACACGTACTTA/GTTCTTTTTGGCATTAACAT)进行巢式PCR扩增。反应体系为:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,引物rp(I)F1和rp(I)R1各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。扩增条件为:95℃ 3 min;95℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 90s,35 cycles;72℃ 10 min。

1.2.3.3 序列分析

将所获得的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测合格后检测送至上海生工测序。利用MegAlign软件对获得的序列进行校正及拼接,提交到GenBank中获得基因序列号。在NCBI中对获得的基因序列Blast在线比对获得同源序列,通过MEGA-X[17]软件Neighbor-Joining(NJ)邻近法构建系统进化树,研究柽柳丛枝植原体在植原体组/亚组的分类地位;并对新疆南疆不同地区柽柳丛枝植原体16S rRNA基因进行遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 南疆柽柳丛枝病分布及危害

2.1.1 柽柳丛枝病田间症状表现

研究表明,与正常的柽柳相比,柽柳丛枝症状主要表现为,在发病初期,叶片簇生,形成从芽状,之后叶片聚合在一区缩短变粗,形成苞状叶,苞状叶再次收缩形成短棒状,短棒状叶片逐渐生长,最终呈现长棒扭曲状干枯死亡,挂在树枝上,感染该病害的柽柳也会表现出秃顶的现象。图1

图1 柽柳丛枝症状

2.1.2 柽柳丛枝病在南疆地区的分布及危害

研究表明,柽柳丛枝病主要发生在阿克苏市温宿县、巴楚县、图木舒克市、阿拉尔市、伽师县、阿拉尔市12团,而在和田地区(224团1、3、7、8连、洛浦县、墨玉县)和昆玉市未发现柽柳丛枝病。柽柳丛枝病在新疆南疆地区的平均发病率为9.06%,平均病情指数为5.66。温宿县和阿拉尔市12团的发病率最高,为19.08%及18.20%,病情指数最高的地区为阿拉尔市12团和阿克苏市(3.45和8.25)。在发病率及病情指数上各地区之间具有显著差异性。表2

表2 不同地区柽柳丛枝病的发病率和病情指数

2.2 柽柳丛枝病病原菌形态学鉴定

研究表明,在10 000X和30 000X透射电镜观察感病组织切片,在植物韧皮部的筛管组织中观察到植原体,菌体较小,形状有球形,椭圆形及不规则形,大小从300～600 nm不等。图2

图2 透射电镜观察

2.3 柽柳丛枝病的分子鉴定

2.3.1 柽柳丛枝病16S rRNA基因和rp基因PCR扩增

研究表明,健康柽柳以及ddH2O均未扩增到特异性条带,而柽柳丛枝16S rRNA基因和rp基因巢式PCR在大约1.2 kb处出现特异性条带。柽柳丛枝16S rRNA基因扩增片段大小为1 200 bp左右(GenBank登录号:MW187566、MW447513、OL687355-OL687381),rp基因扩增片片段大小为1 174 bp(GenBank登录号:MZ365042)。该症状由植原体侵染所致,将其命名为新疆柽柳丛枝植原体(SCWB-XJ)。SCWB-XJ菌株包括12Tuan(OL687355-OL687358)、Wensu(OL687377-OL687381)、Jiashi(OL687369-OL687372)、Tumushuke(OL687373-OL687376)、Alar(MW187566、OL687360-OL687363)、Bachu(OL687364-OL687368)、Aks(MW447513、OL687359)。

2.3.2 柽柳丛枝植原体16S rRNA基因序列分析

研究表明,SCWB 16S rRNA基因序列扩增片段含有1 219个核苷酸,C+G含量为45%(GenBank登录号:MW447513),SCWB-XJ 16S rRNA基因与植原体16S rRNA基因同源性均达到96%以上,其中与16SrXXX组GenBank登录号为FJ432664的16S rRNA基因相似度最高,为99.67%,与16SrX组GenBank登录号为GQ249159和JF730310的相似度为98.03%和96.78%,SCWB-XJ 16S rRNA基因序列植原体其他组(16Sr I-16SrX组)的遗传关系较远,与16SrXXX的亲缘关系最近,其中SCWB-Bachu5(GenBank登录号OL687368)与16SrXXX-A亚组FJ432664序列聚为同一分支,具有较高的亲缘关系,SCWB-XJ最接近16SrXXX-A亚组。图3

图3 基于SCWB的16S rRNA基因序列和相关植原体株系构建的系统发育树

2.3.3 柽柳丛枝植原体rp基因序列

研究表明,SCWB-XJrp基因序列(GenBank登录号:MZ365042)扩增片段含有1 174个核苷酸,C+G含量为26.9%,此序列包含rpS3和rpL22部分序列,分别编码245和120个蛋白质,SCWB-XJrp基因序列与植原体16SrX组GenBank登录号为MG383523和KT9.6161的相似性最高,为84.74%和83.64%。SCWB-XJrp基因序列与其他植原体株系均不在同一分支,与其他植原体株系具有较低的亲缘关系,所以猜测SCWB-XJrp基因属于新的16SrXXX-rp组。rpS3与植原体16SrX组GenBank登录号为AEY94416和AYB35976的相似性最高,为82.27%和82.10%,同源性较低,SCWB-XJ rprp基因属于新的16SrXXX-rp组。图4

图4 基于SCWB的rp基因序列和相关植原体株系构建的系统发育树

2.4 新疆南疆SCWB植原体16S rRNA基因多样性

2.4.1 新疆南疆不同地区柽柳丛枝16S rRNA基因系统和进化

研究表明,可将南疆地区SCWB植原体分为4个类群,分别是(1)阿拉尔市、图木舒克市、巴楚县;(2)温宿县;(3)阿克苏;(4)阿拉尔市12团和伽师。南疆SCWB植原体根据16S rRNA基因序列的差异性,可分为4个株系,分别是SCWB-Alar-Tumushuke-Bachu株系、SCWB-Wensu株系、SCWB-Aks株系和SCWB-12Tuan-Jiashi株系。图5

图5 南疆不同地区SCWB 16S rRNA基因系统进化树

2.4.2 新疆南疆不同地区柽柳丛枝16S rRNA基因同源性

研究表明,7个地区的SCWB植原体16S rRNA基因核苷酸相似度在96.5%-99.8%。其中,伽师县和阿拉尔市、图木舒克市的同源性最高,为99.8%,其次是阿拉尔市和图木舒克市、阿拉尔市12团和伽师县,同源性为99.7%,同源性最低的是阿克苏市和温宿县,为96.5%。伽师县和阿拉尔市的变异度最小为0.2,其次是图木舒克市和阿拉尔市,变异度为0.3,而变异度最大的是温宿县与阿克苏市和巴楚县,变异度为3.6和3.3。表3

3 讨 论

研究结果符合刘仲健等[7]关于植原体形态大小的描述;利用16S rRNA基因和rp基因的扩增及序列分析,根据同源性比对及构建系统发育树,将在新疆南疆地区发现的柽柳丛枝病植原体划分至植原体16SrXXX-A亚组,与Li等[18]的研究结果一致。

4 结 论

新疆南疆柽柳丛枝植原体主要可分为4个株系,分别是SCWB-Alar-Tumushuke-Bachu株系、SCWB-Wensu株系、SCWB-Aks株系和SCWB-12Tuan-Jiashi株系;阿克苏市、温宿县、巴楚县、图木舒克市、阿拉尔市、伽师县、阿拉尔市12团等地的SCWB植原体16S rRNA基因核苷酸相似度在96.5%～99.8%。