油菜素内酯对甜瓜农药残留的降解作用分析

杨世英,马玉娥,贾斌鑫,华震宇,沈 琦,刘峰娟,王 成,3

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052,2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐)/新疆农产品质量安全重点实验室,乌鲁木齐 830091,3.新疆农业科学院,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆是我国重要的甜瓜主产区,常年甜瓜产量约占全国甜瓜总产量的16%左右。[1-3]。研究油菜素内酯(brassinolide,BR)处理对甜瓜中啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑的降解作用及其机理,对油菜内酯在甜瓜中的应用有重要意义。【前人研究进展】在病虫害综合防治中也运用到杀虫剂、杀菌剂等化学农药[4]。BR是一种广泛存在于植物中的天然植物激素[5],对植物的生长和发育,生物和非生物胁迫的发展起着至关重要的作用[6]。【本研究切入点】0.1 mg/L BR 能够显著促进芹菜中阿维菌素和辛硫磷的降解[7]。BR可促进农药在植物体内的降解和代谢[8],在鸭梨[9]等果蔬上进行过类似研究,但是对于BR能否促进甜瓜果实中农残的降解尚鲜有报道。需油菜素内酯对甜瓜农药残留的降解作用分析。【拟解决的关键问题】研究BR处理对甜瓜果实处理后农药残留含量、解毒酶活性、解毒基因表达量、活性氧含量以及解毒物质的影响,分析油菜素内酯对甜瓜果实农药残留降解机理,为油菜素内酯在甜瓜中的应用提供理论参考和支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 甜瓜种子

供试甜瓜种子购自昌吉市金丰种植有限责任公司,种植于新疆农业科学院综合试验场。试验挑选大小均匀、成熟度相同、无损伤、无病害的甜瓜果实。

2,4-表油菜素内酯(索莱宝),乙腈(赛默飞世尔科技中国有限公司),无水硫酸镁(成都市科隆化学品有限公司),氯化钠(天津市盛奥化学试剂有限公司)。陶瓷均质子(河北艺心逸科技有限公司)。多糖多酚总RNA提取试剂盒、FastKing RT Kit (With gDNase)试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计(UV-2700,日本岛津公司),LC-MS串联四极杆液质联用仪(XEVO-TQ,美国沃特世),超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop2000,赛默飞世尔科技有限公司),实时荧光定量PCR仪(LightCycler© 96,上海腾易生物科技有限公司),PCR扩增仪(Surecyder 8800,安捷伦科技有限公司)电泳仪(DYY-8C型,北京佳航博创科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集

选择啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑。处理组将甜瓜分别用1、0.5、0.1和0.01 mg/L的油菜素内酯处理后,喷施啶虫脒3.3 mL/L、多菌灵2.5 g/L、苯醚甲环唑2.5 g/L、腈菌唑2.5 g/L,对照组用相同体积的清水喷施,测定各处理组甜瓜果实中4种农药含量。0.1 mg/L油菜素内酯降解这4种农药残留的效果最好。选取0.1 mg/L油菜素内酯喷施甜瓜。

在甜瓜成熟前24 d左右喷施油菜素内酯,以清水处理做对照,第2 d喷施4种农药,喷施农药后分别于2 h(0 d),1、3、5、7、9、15和24 d,按照GB/T8855-2008采集样品,2020年6～7月完成样品采集。

1.2.2 样品前处理

甜瓜果实(全果不去皮)按照四分法,切分、匀浆处理,称取10 g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈(色谱纯),涡旋1 min,摇床振荡30 min,取出后向离心管中加入2 g NaCl和2 g无水硫酸镁,再涡旋1 min,10 000 r/min常温离心3 min取上清液加入到PSA管中液面刻度线达到10 mL即可,充分振荡1 min,4 000 r/min常温离心5 min取上清液过0.22 μm滤膜加入到进样小瓶中后,测定农药残留。剩余部分切成均匀的小块,用锡纸包好后在液氮中浸泡,等待彻底凝固后放于-20℃保存。

1.2.3 农药残留测定

(1)色谱条件

色谱柱:C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH,50 mm×2.1 mm,1.7 μm,沃特世Waters公司);柱温:40℃;样品室温度10℃;采用二元梯度洗脱分离,以甲醇(A)和1 mmol/L乙酸铵水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,流速0.2 mL/min,进样体积1 μL,运行15 min。梯度洗脱条件:0.0～1.0 min,5%A;1.0～2.0 min,5%～30%A;2～3 min,30%～45%A;3～7 min,45%～95%A;7～12 min,95%A。12～13 min,95%～5%A,13～15 min,5%A。

(2)质谱条件

采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)电喷雾离子源,选择反应监测(SRM)电离源模式为电喷雾离子化(ESI),离子源极性为ESI+;离子源温度:350℃;气体流量:N2:1.0 L/h;Ar:0 mL/min;毛细管电压:3.00 kV;脱溶剂温度:650℃;锥孔气流量:0 L/h;六级杆透镜电压:0 V。

1.2.4 酶活、代谢产物、活性氧代谢

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性,丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、超氧阴离子(O2-)、还原型谷胱甘肽含量的测定参照曹建康[10]方法。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化氢含量采用索莱宝试剂盒进行测定。

1.2.5 解毒基因表达量

甜瓜总RNA的提取:采用多糖多酚总RNA提取试剂盒。

反转录:使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA。

引物设计:从NCBI官网查找甜瓜果实中POD、APX、CAT、PAL、SOD、POD 6种解毒基因序列,再通过软件Primer 5.0设计引物,引物设计好之后,使用blast工具对设计出的引物进行检测,将检测合格的引物送至上海生工生物工程有限公司合成。

RT-PCR反应:以反转录合成得到的cDNA为模板,根据SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒配制反应体系。

上机测定:在实时荧光定量PCR仪(LightCycler®96)上完成。

1.3 数据处理

用Origin2018软件录入数据并作图,用SPSS26.0软件对数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA),用邓肯氏多重差异进行比较,当P<0.05时,表示差异显著,当P<0.01时,表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 BR处理对甜瓜果实中农残含量的影响

研究表明,BR处理组甜瓜果实中苯醚甲环唑含量一直低于对照组果实含量。3～24 d处理组果实中苯醚甲环唑含量基本保持在0.05 mg/kg左右,而对照组在缓慢下降,到第24 d处理组相比于对照组降低了15.26%。在整个采样过程中甜瓜果实中苯醚甲环唑含量始终小于最大限量值0.7 mg/kg,BR能有效降低甜瓜果实中苯醚甲环唑的含量。

BR处理组甜瓜果实中啶虫脒含量除了第1 d高于对照组外,其余采样期间均低于对照组。3～24 d BR处理组果实中啶虫脒含量相比于对照组分别下降了97.06%,51.30%,47.70%,53.14%,65.52%和22.30%。在整个采样过程中甜瓜果实中啶虫脒含量始终小于最大限量值2 mg/kg。BR能够有效减少甜瓜果实中啶虫脒的含量。

BR处理组和对照组分别在第1 d和第3 d达到最大值,分别为0.67和0.72 mg/kg,处理组相比于对照组降低了6.94%,第7 d,处理组与对照组果实中多菌灵含量都在0.6 mg/kg左右,7～24 d,处理组与对照组都急剧下降,第24 d,处理组果实中多菌灵含量相比于对照组降低了45.12%。BR在一定程度上能降低甜瓜果实中多菌灵的含量。

喷施农药后第1 d,处理组相比于对照组降低了44.44%,3～7 d处理组与对照组正好相反,处理组缓慢上升,对照组缓慢下降,7～15 d两组趋势相同都是向上高后下降。第24 d BR处理组比对照组下降了31.25%。BR能在一定程度上降低甜瓜果实中腈菌唑的含量。图1

图1 不同BR处理下甜瓜果实中4种农残含量变化

在整个采样期间BR处理组甜瓜果实中农残总含量显著低于对照组。第1 d对照组果实中农药残留是BR处理组的1.29倍。3～24 d 2组的变化趋势大致相同。第24 d时BR处理组果实中农药残留的含量相比于对照组降低了36.36%。BR处理能有效降低甜瓜果实中农药残留的含量。图2

图2 不同BR处理下甜瓜果实中农残含量变化

2.2 BR对甜瓜果实中活性氧代谢的影响

研究表明,甜瓜在喷施农药后,对照组0～1 d超氧阴离子产生速率急剧下降,1～24 d超氧阴离子产生速率趋于平缓;BR处理组0～1 d缓慢下降,1～7 d缓慢上升,7～9 d缓慢下降。第24 d处理组与对照组超氧阴离子产生速率大致相等。BR处理可以能够有效抑制甜瓜果实中超氧阴离子的产生速率。

BR处理组在喷施农药第1 d时甜瓜果实中过氧化氢含量高于对照组32.67%(P<0.05)。喷施农药0～1 d处理组过氧化氢含量相比于对照组急剧上升,1～3 d处理组与对照组均急剧下降,3～15 d处理组下降趋势放缓,而对照组先急剧上升后缓慢下降,15～24 d两者均急剧上升。BR处理能有效提高甜瓜果实中过氧化氢含量的积累。

BR可能将甜瓜果实代谢产生的不稳定的超氧阴离子转化为更为稳定的过氧化氢,减少超氧阴离子对细胞的损害。图3

图3 不同BR处理下对甜瓜果实中活性氧代谢变化

2.3 BR处理对甜瓜果实中解毒酶活性和解毒基因表达量的影响

2.3.1 BR处理对甜瓜果实中解毒酶活性的影响

研究表明,在整个采样期间,只有第3 d和第7 d BR处理组甜瓜果实中抗坏血酸过氧化物酶的活性略高于对照组果实中的酶活性,其余期间BR处理组果实中的酶活性均显著小于对照组果实中的酶活性,并且处理组与对照组甜瓜果实中抗坏血酸过氧化物酶的活性起始值与结束值基本保持一致。BR处理未能有效提高甜瓜果实中抗坏血酸过氧化物酶的活性。

BR处理组在喷药后的整个采样期间甜瓜果实中过氧化氢酶的活性显著高于对照组。0～1 d BR处理组比对照组高出46.47%(P<0.05)。1～7 d 两组呈现出先急剧下降后急剧上升的趋势。7～24 d BR处理组果实中酶活性先急剧下降后缓慢上升,对照组果实中酶活性一直稳定在11左右。BR处理在一定程度上能够有效提高甜瓜果实中过氧化氢酶活性。

喷施农药后,在整个采样期间BR处理组甜瓜果实谷胱甘肽还原酶活性一直显著高于对照组果实。BR处理组甜瓜果实酶活性在第7 d达到最大值1.399,是对照组果实的9.26倍(P<0.05),对照组甜瓜果实中酶活性在第1 d达到最大值0.58。BR能够有效促进甜瓜果实中谷胱甘肽还原酶的活性。

甜瓜喷施农药后在整个采样期间BR处理组果实中苯丙氨酸解氨酶活性一直显著高于对照组果实。采样第3 d BR处理组相比于对照组高出了139.64%(P<0.05),第24 d处理组果实中酶活性比对照组高出12.34%。BR能在一定程度上有效提高甜瓜果实中苯丙氨酸解氨酶的活性。

BR处理组甜瓜果实中超氧化物歧化酶的活性在整个采样时期除第15 d外,其余均高于对照组,但差异不显著。BR处理组在第1 d相比于对照组上升了3.23%,第24 d BR处理组甜瓜果实中超氧化物酶活性比对照果实酶活性高0.48%。BR可以在一定程度上有效的提高甜瓜果实中超氧化物歧化酶的活性。

在整个采样期间BR处理组甜瓜果实中过氧化物酶活性一直显著高于对照组。第24 d BR处理组甜瓜果实中过氧化物酶活性高于对照组11.36%(P<0.05),BR处理甜瓜能够在一定程度上有效提高果实中过氧化物酶的活性。图4

图4 不同BR处理下对甜瓜果实中解毒酶活性变化

2.3.2 BR处理对甜瓜果实中解毒基因表达量的影响

研究表明,APX基因表达量BR处理组始终处于对照组上方,采样第0、3、7和9 d,BR处理组与对照组无显著差异,采样第1、5、15和24 d,BR处理组相比于对照组甜瓜果实中APX基因表达量分别提高了66.67%、166.67%、27.12%、104%。在整个采样期间BR处理组与对照组相比APX基因表达量平均提高了30.43%。

CAT基因的表达量BR处理组与对照组在整个采样期间均在1附近上下波动。除采样第3 d,BR处理组CAT表达量低于对照组,其余天数均高于对照组,其中第1 d喷施BR对甜瓜果实中CAT基因表达量促进效果显著比对照组提高了138.71%,CAT基因表达水平BR处理组与对照组相比平均提高了17.08%。

甜瓜果实中GR基因的表达量除第9 d BR处理组比对照组低外,其余采样时间BR处理组均在对照组上方,在整个采样期间BR处理组与对照组相比GR基因表达量平均提高了10.08%。

采样7、9、24 d,BR处理组与对照组相比甜瓜果实中PAL基因的表达量分别提高了17.28%、7.69%、41.90%(P<0.05),其余天数BR处理组与对照组相比甜瓜果实中PAL基因的表达量无显著提高,在整个采样期间BR处理组与对照组相比PAL基因表达量平均提高了5.81%。

BR处理组整体处于对照组的上方,采样第3、7、15、24 d,BR处理组与对照组相比甜瓜果实中SOD基因的表达量分别提高了22.22%、13.33%、79.37%、21.70%(P<0.05),其余采样天数BR处理组相比与对照组无显著提高。在整个采样期间BR处理组与对照组相比SOD基因表达量平均提高了14.23%。

甜瓜果实中POD基因表达量BR处理组与对照组相比,除采样第1、7、9、24 d无显著提高,0、3、5、15 d分别提高了58%、34.85%、12.31%、16.26%(P<0.05),在整个采样期间BR处理组与对照组相比POD基因表达量平均提高了12.88%。

喷施BR能显著提高APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD解毒基因的表达量,分别平均提高了30.43%、17.08%、10.08%、5.81%、14.23%、12.88%。图5

图5 不同BR处理下甜瓜果实中六种解毒基因表达量变化

2.4 BR处理对甜瓜果实中生理代谢的影响

研究表明,喷施农药后的整个采样期间BR处理组果实中还原型谷胱甘肽含量一直显著高于对照组果实。BR处理组第3 d相比于对照组提高了62.5%(P<0.05),3～15 d以后BR处理组与对照组果实中还原型谷胱甘肽含量都急剧下降。15～24 dBR处理组与对照组都有略微上升。BR处理能有效提高甜瓜果实中还原型谷胱甘肽含量。

喷施农药后在整个采样期间对照组甜瓜果实中MDA含量一直显著高于BR处理组果实中MDA含量。第24 d处理组果实MDA含量与对照组相比,低了25%左右,BR处理能够有效抑制甜瓜果实中MDA含量。

喷施农药后在采样的第0、3、5和7 d,BR处理组甜瓜果实中可溶性蛋白质含量分别显著高于对照组果实的22.86%、150.36%、16.02%、81.36%(P<0.05),采样第9～24 d,BR处理组果实中可溶性蛋白质含量显著低于对照组果实中可溶性蛋白质含量,BR处理能有效提高喷施农药后前期甜瓜果实中可溶性蛋白质含量。图6

图6 不同BR处理下甜瓜果实中生理代谢变化

3 讨 论

3.1当植物受到农药胁迫时,油菜素内酯可以激活植物的抗氧化防御系统,促进农药降解[11-13]。Sharma等[14]研究发现,BR处理芥菜型油菜种子后,使得SOD、CAT、GR、POD等解毒酶活性增强,GSH含量提高,SOD、CAT、GR、POD等解毒基因的表达增强,减少了芥菜幼苗中超过38%吡虫啉残留。陶媛[15]的研究表明,喷洒油菜素内酯可显著提高番茄对百菌清(CHT)的抵抗能力,且番茄体内催化降解农药的基因增加 4%。韭菜和大蒜幼苗喷施BR后,叶片中解毒酶活性有显著提升,从而缓解了多种农药的毒害作用[16,17]。汪季涛[18]研究发现番茄喷施杀菌剂和杀虫剂后,GSH含量显著提高,且GR、POD相关解毒酶活力及解毒相关基因的表达量也有明显升高。外源喷施BR可以显著提高半夏的块茎中可溶性蛋白含量和PAL酶的活性[19]。研究发现,甜瓜喷施BR后,提高了甜瓜果实中POD、CAT、GR、PAL解毒酶的活性,APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD相关解毒基因的表达量也有所提高,促进了甜瓜农药残留的降解,与上述研究结果相类似。

3.2植物处于逆境环境中,体内的代谢平衡被打破,使解毒系统整体下降,活性氧不断累积,从而使机体受到胁迫伤害,但外源BR处理可以维持活性氧代谢的平衡,减缓胁迫造成的伤害。外源2,4-表油菜素内酯预处理能够降低黄瓜叶片中H2O2和O2-的积累,维持植物体内氧化还原平衡[20]。番茄提前喷施BR,能使番茄在逆境环境中更加迅速地激活抗氧化酶系统来清除细胞所产生的H2O2和O2-[21]。BR喷施黄瓜后叶片中H2O2水平显著提高[22],研究发现H2O2在活性氧代谢中对机体的毒害作用最小,可以以一种重要的信号分子来调节植物的生长发育过程[23]。试验中BR处理使甜瓜果实中O2-含量在0～5 d显著降低,可能由于BR提高了SOD、CAT、POD等解毒酶活性以及蛋白质等解毒物质的总体含量,进而达到加速机体中过氧化物质的排除。试验中经处理后的甜瓜H2O2含量显著升高,且BR处理组甜瓜果实中H2O2含量始终高于对照组,BR在一定程度上能提高甜瓜果实中H2O2含量,激活甜瓜的活性氧代谢系统,降低农药残留。

3.3叶片喷施不同浓度的EBR可使可溶性蛋白质含量显著升高,对稳定细胞膜的结构具有积极作用[24]。试验结果表明,BR处理可以在前期增高甜瓜果实渗透调节物质(可溶性蛋白)含量,使得植物细胞膜保持稳定状态。在非生物胁迫下,MDA含量会显著增高,降低细胞膜的流动性,破坏离子平衡,对植物细胞膜造成损伤[25]。EBR处理有效抑制了辣椒果实MDA含量的积累,减缓了总解毒能力的下降,较好地保持辣椒果实中解毒酶的活性,防止活性氧的过量积累对辣椒机体造成损害,保护细胞膜的完整性和功能性[26]。在整个采样期间,BR处理组甜瓜果实中丙二醛含量显著低于清水对照组。GSH是农药降解代谢中重要的中间物质,在植物体内农药降解代谢中起着重要的调控作用,BR能够促进植物体内谷胱甘肽等相关物质的合成,通过调控谷胱甘肽相关物质代谢而促进植物体内的农药代谢[27]。研究表明,BR处理使甜瓜果实中GSH含量显著增加,可能由于喷施农药而激发了植物体内的保护机制,进而使解毒物质含量快速升高。

BR可显著加速农药残留的降解,其机制可能与激发植物内在解毒机制有关。油菜素内酯处理能显著促进番茄、黄瓜、辣椒等作物中毒死蜱、百菌清等农药残留的降解[28,29]。Zhou 等[30]指出0.1 mmol/L EBR处理可使水稻、茶叶、西兰花、草莓等植物上常见有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类农药残留量减少 30%～70%。试验中,甜瓜通过喷施BR而使得最终甜瓜果实中啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑四种农残含量都显著降低,是因为BR提高了甜瓜果实中解毒酶活性、解毒基因表达量、解毒物质含量,从而达到的效果。

4 结 论

4.1BR能有效加速甜瓜果实中啶虫脒、多菌灵、苯醚甲环唑、腈菌唑的降解速率,在采样第24 d,相比于对照组的4种农药残留量分别降低了22.30%,45.12%,15.26%,31.25%。

4.2BR处理使在农药处理下甜瓜果实中O2-产生速率显著降低,而H2O2在一定程度上含量有所上升;BR处理使得甜瓜果实中解毒酶(POD、CAT、GR、PAL)活性总体处于较高的水平;同时BR处理可以增高甜瓜果实前期渗透调节物质(可溶性蛋白)含量,显著降低MDA含量,显著提高GSH的含量。

4.3喷施BR能显著提高APX、CAT、GR、PAL、SOD、POD解毒基因的表达量。