受体酪氨酸激酶样孤儿受体1与肿瘤细胞信号通路关系的研究进展

其力木格, 李雪连, 纪 强

(1. 阳光融和医院 药学部 临床药学室, 山东 潍坊, 261061;2. 哈尔滨医科大学 药学院 药理教研室 心血管药物研究教育部重点实验室, 黑龙江 哈尔滨, 150081)

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员之一,是人类神经母细胞瘤细胞系中的一种高度保守的I型单次跨膜蛋白,被发现时其配体未知,故命名为孤儿受体,存在于人类、鸡、小鼠、斑马鱼、果蝇和蛔虫等多种物种中[1-2]。ROR1在小鼠胚胎早期起重要作用,出生后表达下降,在人正常组织中几乎不表达[3]。研究[4]发现, ROR1是一种重要的癌胚蛋白,在多种恶性肿瘤中的表达远高于相邻正常组织。ROR1通过激活多种细胞内信号传导通路来影响肿瘤的发生及发展[5]。本文就ROR1通过细胞内信号转导通路对恶性肿瘤发挥作用的研究现状展开综述。

1 ROR1通过Wnt信号通路对恶性肿瘤的作用

Wnt(Wingless/Integrated)信号通路可调节细胞增殖、迁移和分化,在胚胎发育和成人组织稳态的维持中发挥重要作用,其信号转导功能障碍存在于包括癌症在内的多种人类疾病[6]。Wnt信号通路分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路,后者包括Wnt/平面细胞极性(PCP)和Wnt/Ca2+通路[7]。最近研究[8]发现新的非经典Wnt通路,即通过ROR1介导的Wnt/ROR1信号通路,可与部分Wnt配体相互作用。在结构上,ROR1的富含半胱氨酸结构域(CRD)与卷曲蛋白(FZD)受体的CRD相似,已被确定为Wnt配体结合的必要结构域[9]。

1.1 Wnt5a/ROR1信号传导通路

FUKUDA T等[10]在人胚肾细胞(HEK293T)共转染NF-κB报告基因、β-半乳糖苷酶(β-gal)载体以及编码ROR1、Wnt5a、Wnt3、Wnt5b和Wnt16的表达载体,并通过免疫共沉淀技术分析发现, ROR1只与Wnt5a基因共表达,进而诱导NF-κB激活,但未激活淋巴增强因子/T细胞转录因子(LEF/TCF)、活化T细胞核因子(NFAT)和激活蛋白-1(AP-1)的报告基因,表明ROR1可与Wnt5a相互作用,且活化NF-κB,而不是经典Wnt信号转导通路。GHADERI A等[11]进一步证实了Wnt5a为ROR1的配体,其通过激活非经典Wnt信号通路来刺激ROR1信号通路。

在慢性淋巴细胞白血病(CLL)的细胞中, Wnt5a可诱导ROR1与ROR2形成异质低聚物,并激活鸟嘌呤交换因子(GEF)和Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶(GTPases),从而促进细胞的侵袭或迁移,也可通过诱导ROR1与胞质分裂作用因子2(DOCK2)相互作用来激活大鼠肉瘤病毒相关C3肉毒菌毒素底物1(Rac1/2), 进而促进细胞增殖。然而,KAN0439834(535 Da)作为一种ROR1选择性抑制剂,可抑制Wnt5a对ROR1的磷酸化作用,从而发挥细胞凋亡和抑制细胞生存作用[12-13]。

在黑素瘤中, ROR1的下调会导致ROR2和Wnt5a的表达增加,而ROR2的下调会刺激ROR1的表达[8]。Wnt5a也可以导致ROR1招募造血系细胞特异性蛋白-1(HS1)与细胞皮质区肌动蛋白结合蛋白,HS1细胞皮质区肌动蛋白结合蛋白复合物将ROR1连接到肌动蛋白细胞骨架上,从而促进平面细胞极性、丝状伪足的形成和趋化因子定向迁移[14]。在细胞外, Wnt5a与ROR1的CRD的结合可以触发ROR1信号通路的激活,最终在细胞核中表达细胞外信号调节酶1/2(ERK1/2)、核转录因子κB(NF-κB)和核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)靶基因[4]。

由此可见, Wnt5a-ROR1结合可能通过诱导Rac1/2、GTP、NF-κB、ERK1/2、NRF2激活非典型Wnt通路,以维持细胞存活和增殖。

1.2 Wnt5b/ROR1信号传导通路

Wnt5b与ROR1结合后激活蓬乱蛋白2/3(DVL2/3)、Rac1、细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)、SIN3转录调节因子家族成员A(Sin3A)信号传导和抑制β-catenin活性,从而抑制成骨细胞的分化[15]。人类Wnt5b是非典型的Wnt配体受体,通过FZD3或FZD6受体以及ROR1、ROR2或蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)共受体传导Wnt/PCP信号[16]。

1.3 Wnt3a/ROR1信号传导通路

研究[17]证明,在HEK293T细胞共转染ROR1与Wnt5a和Wnt3a时,可抑制Wnt3a诱导的报告基因质粒活性,并呈剂量依赖性,表明Wnt5a和ROR1可能通过抑制Wnt3a信号通路来调控卵巢发育。

1.4 Wnt9a/ROR1信号传导通路

共表达Wnts和ROR1或ROR2的HEK293T细胞提取物的免疫共沉淀实验结果表明, Wnt9a(曾称Wnt14)可以与ROR1相互作用,且Wnt9a是通过与ROR1的免疫球蛋白样结构域结合而发挥其作用[18]。ROR1和Wnt9a在成人肌肉骨骼系统的再生和维持中起着关键作用[19-20]。ROR1hyp/hyp和Wnt9a-/-单突变体均没有显示出与腭裂表型, ROR1hyp/hyp没有表现长骨相关表型, Wnt9a突变体仅显示出轻微的缩短; 然而在ROR1hyp/hyp与Wnt9a-/-双突变体模型中表现出较短的长骨; 还观察到腭裂继发性表型,这表明ROR1在基因上与Wnt9a相互作用,且ROR1和Wnt9a的下游通路在软骨细胞成熟过程中汇聚并协同作用[18]。

1.5 Wnt16b/ROR1信号传导通路

在t(1; 19)(q23; p13)异位的B前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)中过表达的ROR1和Wnt16b均不激活经典的Wnt信号通路,而是通过上调Rho GTPases来驱动非典型Wnt通路激活,从而促进增殖生存和抑制分化,表明这些细胞中可能存在Wnt16b/ROR1信号通路[21]。对ROR1和Wnt16共转染的HEK293T细胞的ROR1免疫沉淀样本进行蛋白印迹(WB)分析,结果显示ROR1和Wnt16之间存在直接相互作用,提示Wnt16可能是ROR1的另一种配体[22]。

2 ROR1通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路对恶性肿瘤的作用

PI3K/Akt/mTOR信号通路在信号转导和细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成等生物调节中起重要作用[23]。在许多肿瘤实体中, ROR1的激活会导致PI3K、Akt、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)和mTOR以及其下游靶点核糖体蛋白S6(RPS6)和重组人翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的磷酸化[24-25]。

2.1 ROR1通过PI3K/Akt/mTOR对血液及淋巴肿瘤的作用

在套细胞淋巴瘤(MCL)中, ROR1的异常表达可激活PI3K-Akt细胞信号通路,从而促进MCL细胞的生长[26]。

研究[27]表明, ROR1是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)生存的新型预后标志物, ROR1通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路显著促进DLBCL肿瘤发生。肺腺癌细胞株用siRNA沉默ROR1可显著抑制Akt、mTOR、Raptor和核糖体40s小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)Thr389部位的磷酸化,并显著降低体外肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力,这表明ROR1可能通过Akt/mTOR信号在肺腺癌的肿瘤进展和转移中发挥关键作用[28]。

将从接受Cirmtuzumab(ROR1特异性抗体)治疗的CLL患者分离的细胞用转录组测序技术(RNA-seq)进行分析,发现ROR1的特异性抗体降低了mTORC1(mTOR含有2种复合体: mTORC1、mTORC2)诱导的基因,表明mTORC1通路是ROR1的下游信号通路[29]。

2.2 ROR1通过PI3K/Akt/mTOR对呼吸系统肿瘤的作用

在PC-9人肺腺癌细胞中,阻断ROR1显著下调了细胞周期诱导分子CDK4和Cyclin E1及抗凋亡分子Bcl-XL和Bcl-2的表达,同时显著上调了Bak、Caspase-3和Caspase-7等促凋亡分子的表达,导致Akt失活,并通过去磷酸化激活糖原合成酶激酶3α/β(GSK3α/β), 最后使mTOR失活,从而有效地调节肺癌的细胞周期、细胞凋亡和自噬等[30]。在NSCLC细胞中沉默ROR1后发现, GSK3β、磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)、Akt、mTOR和核糖体蛋白S6激酶β1(RPS6Kβ1)等Akt/mTOR信号通路关键分子的活性显著降低[31]。评估ROR1对肺腺癌靶向治疗的适用性研究[32]发现,在人肺腺癌细胞沉默ROR1后显著下调了PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性,这与肿瘤细胞的凋亡和抗增殖有关。在肺腺癌中,过表达的ROR1很可能对维持存活期PI3K-Akt和促凋亡p38信号传导之间的有利平衡发挥作用[33]。

2.3 ROR1通过PI3K/Akt/mTOR对乳腺肿瘤的作用

在人类乳腺癌的肿瘤细胞, ROR1与酪蛋白激酶1(CK1)的相互作用可使PI3K介导的Akt磷酸化和激活CREB[34]。在三阴性乳腺癌中,木麻黄素可抑制ROR1的磷酸化Akt为p-Akt作用,进而抑制下游GSK3β的磷酸化,最终导致细胞存活率的降低和激活半胱氨酸蛋白酶级联反应[35]。

2.4 ROR1通过PI3K/Akt/mTOR对其他恶性肿瘤的作用

ROR1通过蓬乱蛋白相关形态形成活化因子1(Daam1)和PI3K/Akt信号通路激活RhoA, 并调节骨肉瘤细胞的迁移[36]。在人绒毛膜滋养层细胞过表达的ROR1通过上调PI3K/Akt/mTOR通路中关键激酶的磷酸化水平而促进细胞增殖、迁移和侵袭,而ROR1表达被干扰时具有相反的效果[37]。

3 ROR1与Hippo-YAP信号传导通路

Hippo信号通路是由一组保守的激酶构成的抑制细胞生长的信号通路, Yes关联蛋白(YAP)为其核心效应分子,是一个候选致癌因子[38]。近年研究[39]证实,Hippo信号传导通路还在癌症发生、组织再生以及干细胞的功能调控方面发挥着重要的作用。

研究[40]证明,神经肽1触发ROR1和人表皮生长因子受体3(HER3)的异源二聚化,导致HER3的Tyr1307位点磷酸化, p-HER3募集幼虫巨大致死性基因2(Lgl2)、lncRNA MAYA和tRNA 5-甲基胞嘧啶-甲基转移酶(NSUN6)为LLgl2-MAYA-NSUN6复合物,后者使Lys59处的Hippo/Mst1甲基化,导致Mst1的失活和YAP靶基因的激活,从而引起破骨细胞分化和骨吸收。

抗体药物结合恩美曲妥珠单抗(T-DM1)治疗HER2阳性乳腺癌可诱导ROR1的表达,后者再通过激活Hippo转录共激活因子YAP1, 从而产生耐药,并且抑制YAP1可限制T-DM1治疗诱导的ROR1过表达和肿瘤干细胞(CSC)自我更新[41]。Wnt5a结合ROR1/FZD复合体后激活RhoAα12/13, 并导致大肿瘤抑制因子1/2(Lats1/2)活性的抑制,从而引起YAP/TAZ(基于PDZ结合基序的转录共激活子)去磷酸化和核易位, YAP/TAZ转录水平的升高又可以上调ROR1的表达[42]。

4 ROR1与JNK信号传导通路

NADANAKA S等[43]发现,硫酸软骨素通过MDA-MB-231细胞中的ROR1/JNK轴促进癌症侵袭性。在B细胞淋巴细胞白血病中,ROR1通过上调JNK信号诱导细胞侵袭性、转移能力和治疗抵抗[44]。

5 ROR1与NF-κB信号传导通路

在豚鼠耳蜗毛细胞,ROR1与Wnt5a相互作用,通过诱导p65的磷酸化来激活NF-κB信号通路,且Wnt5a依赖性NF-κB信号通路可减少过表达ROR1的噪声性听力损失(NIHL)豚鼠的听力受损[45]。FUKUDA T等[10]研究发现,在HEK293细胞中共表达Wnt5a与ROR1可诱导NF-κB的活化,并增强CLL细胞在体外的存活率,然而该作用被抗ROR1抗血清所中和。

6 ROR1与ERK信号传导通路

细胞外调节蛋白激酶(ERK)是胚胎发生,细胞分化,细胞增殖和细胞死亡调控的关键组成部分,ERK途径起源于质膜中的活化受体,并通过Ras/Raf/MEK至ERK[46]。在MCL细胞中,ROR1与CD19结合形成ROR1/CD19复合物,并以B细胞抗原受体(BCR)信号通路独立的方式激活MEK-ERK信号通路,从而促进细胞生长[26]。

7 ROR1与STAT3信号传导途径

信号传导与转录激活因子3(STAT3)最早被发现为癌基因,参与调控细胞生长、分化、凋亡等生理途径[47]。

IKEDA T等[48]研究发现,在肿瘤微环境中, Wnt5a-ROR2信号通路在骨髓间充质干细胞(MSC)中诱导CXCL16的表达, CXCL16以旁分泌的方式作用于人胃癌细胞(MKN45)激活CXCR6, 进而刺激STAT3信号通路,最终诱导MKN45细胞中ROR1的表达,产生促进肿瘤的增殖和迁移作用。在CLL细胞中,凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫沉淀技术(ChIP)研究[49]表明,激活的STAT3与ROR1启动子结合,激活ROR1, 并诱导CLL细胞中ROR1蛋白的产生。研究[50]发现, Wnt5a-ROR1信号通过激活RhoA/Rac1 GTPases和上调STAT3来活化非规范Wnt信号,从而增强TCF3-PBX1细胞的存活和增殖[12]。研究发现白细胞介素6(IL-6)通过激活ROR1, 诱导STAT3磷酸化,并以时间和剂量依赖的方式上调ROR1蛋白水平。

8 靶向ROR1肿瘤免疫治疗

8.1 应用于肿瘤免疫治疗的单克隆抗体

单克隆抗体是人体细胞特异性识别、抵抗病原微生物入侵产生的物质,可直接阻断配体结合,激活免疫系统消除肿瘤细胞,具有特异性强、灵敏度高、毒性低等优点。单克隆抗体主要应用于临床诊疗,中国已研制出300多种用于肿瘤治疗的单克隆抗体。目前,针对ROR1不同结构域(CRD结构域、Ig结构域、Kringle结构域)构建的抗ROR1单克隆抗体已经被开发出来,可产生明显的抗体依赖性毒性或补体依赖性毒性,使肿瘤细胞凋亡加剧[51]。有研究利用小鼠抗ROR1单克隆抗体5F1-B10评估ROR1在膀胱癌细胞表面的表达,流式细胞术结果显示5F1-B10单抗在人膀胱细胞系5637、EJ138中分别能识别86.1%和45.6%的ROR1分子。ROR1在非癌性人胎包皮成纤维细胞(HFFF)中表达量为5.49%。免疫细胞化学和免疫组织化学染色结果也证实了ROR1分别存在于膀胱癌细胞和组织表面。细胞凋亡实验结果表明, 5F1-B10单抗可诱导5637和EJ138细胞株凋亡。该研究[52]认为ROR1可能是开发新型膀胱癌治疗药物的一个有希望的靶点。另外,有研究提供了抗ROR1单克隆抗体Zilovertamab在高级别浆液性卵巢癌、子宫内膜癌中的临床前证据。单药Zilovertamab在72 h内能显著抑制高级别浆液性卵巢癌细胞和子宫内膜癌细胞的增殖, Ⅰ期临床试验中显示出Zilovertamab血浆半衰期为32.4 d[53]。靶向ROR1的Cirmtuzumab人源化单克隆抗体也在临床试验中进行了评估,在cirmtuzumab治疗CLL患者的Ⅰ期试验中观察到有益的效果,可抑制CLL患者肿瘤细胞ROR1信号传导[54]。

8.2 应用于肿瘤免疫治疗的基因工程抗体

基因工程抗体是指将编码抗体的基因进行加工改造后转染受体细胞表达所得的抗体,又称为重组抗体。基于ROR1靶向单克隆抗体, ROR1靶向基因工程抗体也被开发出来,包括单链片段可变抗体(scFv)、Fab抗体片段、抗体药物偶联物(ADC)等。

scFv是由抗体重链可变区、轻链可变区在一段肽链的连接下构成的小分子,是具有抗体活性的最小功能结构单位,相对于单克隆抗体而言,scFv分子质量小,穿透力强,半衰期短,免疫原性低,在药代动力学、药效学方面具有潜在的治疗优势。AGHEBATI-MALEKI L等[55]利用噬菌体展示技术选择了针对ROR1细胞外区域特定肽的scFvs, 结果表明,分离的scFvs对ROR1肽具有特异性反应。scFv对多发性骨髓瘤细胞和CLL细胞的生长有显著抑制作用。此外,用特异性scFv处理24 h可诱导多发性骨髓瘤细胞和CLL细胞凋亡。该研究结果表明,使用肽特异性scFv靶向ROR1可能是一种有效的血液恶性肿瘤免疫治疗策略。

Fab片段是由一条完整的轻链与重链的VH和CH1结构域(Fd段)组成,也叫做抗原结合片段,分子量约5×104。Fab类抗体片段具有分子质量小、免疫原性低、组织特异性强、可基因工程操作等特点,使Fab成为了医药研究领域的重要成员之一。嵌合Fab片段是由鼠源可变区和人源恒定区组成, YIN Z N等[56]研究开发了一种新型嵌合抗ROR1 Fab抗体(ROR1-cFab), 该研究通过三轮亚克隆亲和筛选,将ROR1免疫滴度高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,构建ROR1-cfab阳性融合细胞原核表达载体,发现ROR1-cfab可以特异性结合ROR1蛋白和ROR1阳性卵巢癌A2780细胞,并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,诱导ROR1阳性A2780细胞凋亡,且呈剂量依赖性。该研究[56]认为ROR1-cfab是一种新型的抗ROR1抗体,是治疗ROR1阳性卵巢癌的可能候选者之一。

ADC是将单克隆抗体和强效高毒性小分子毒物通过生物活性连接子偶联而成的定点靶向癌细胞的强效抗癌药物, ADC既能保证靶向性,又能改善细胞毒药物的治疗窗,被认为是未来疾病治疗的重要手段。VLS-101是一种ADC, 用于治疗表达ROR1(ROR1+)的癌症,中国于2022年批准其用于治疗难治性或复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤。VLS-101包括UC-961(一种人源化免疫球蛋白G1单克隆抗体,可结合人ROR1的细胞外表位),一种马酰亚胺丙基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酸酯连接物,以及一种微管聚合抑制剂单甲基奥瑞他汀E (MMAE)。VLS-101与ROR1的结合导致MMAE的快速细胞内化和传递,从而诱导肿瘤细胞死亡。VAISITTI T等[57]研究了4例RS患者来源的异种移植模型,其具有不同水平的ROR1表达(11%、32%、85%和99%), VLS-101对表达ROR1最低的患者无效,但可完全缓解ROR1表达水平较高患者的肿瘤负担。

9 小 结

综上所述, ROR1是肿瘤相关信号传导通路的重要成员,可以结合配体并激活下游的信号通路,对各种肿瘤细胞的增殖、生存、生长、迁移和转移中发挥关键作用。虽然有研究揭示了ROR1在癌症中的促肿瘤功能,但其在不同肿瘤中的调节机制和在肿瘤发生中的作用还不完全清楚。在各种临床前模型中, ROR1结合小分子抑制ROR1可诱导肿瘤细胞显著凋亡并抑制肿瘤细胞功能,充分了解ROR1的结构特征以及下游信号转导等生物学特性,可优化在血液和非血液恶性肿瘤中的ROR1靶向癌症治疗方案。目前开发了许多靶向ROR1的抗体,可特异性识别肿瘤抗原,高效杀灭肿瘤细胞,但获得上市批准的药物不多,期待将来会有更多的靶向ROR1应用于肿瘤免疫治疗。