卵圆孔未闭合并偏头痛患者NTRK3基因表达水平及其与临床指标相关性分析

李元明, 郝 娟, 伊斯拉木江·吐尔逊, 陈家骅

(1. 新疆医科大学第二附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830063;2. 新疆维吾尔自治区人民医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

卵圆孔未闭(PFO)是临床较常见的一种先天性心脏发育异常,其发病机制与遗传基因突变密切相关[1]。近年来,心脏超声技术不断发展,使得人们对右向左分流(RLS)现象认识深入, PFO导致的多种病理改变也逐渐受到临床重视[2]。偏头痛(MA)是青少年临床常见疾病之一,严重影响患者日常生活质量,也是致残的主要原因之一,目前MA治疗效果欠佳[3]。PFO患者罹患MA概率是普通人群的2～3倍。上述2种临床症状均发病机制不清,临床认为均与患者某些基因表达水平的改变相关[4]。研究[5]认为,神经营养受体酪氨酸激酶3(NTRK3)基因与圆锥动脉干畸形密切相关,其表达在先天性心脏病患儿心肌组织中显著减低。而PFO合并MA患者的NTRK3基因表达情况以及与临床重要指标和患者预后是否存在相关性的临床研究较少。因此,本研究探讨PFO合并MA患者的NTRK3基因表达情况,有助于临床对PFO合并MA患者进行针对性治疗,并改善疗效及预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1月—2022年12月收治的86例确诊PFO患者为研究对象,其中男42例,女44例; 年龄14～41岁,中位数年龄为25岁。患者本人或监护人均书面签署知情同意书。纳入标准: ① 经胸超声心动图声学造影及经食管超声心动图诊断为PFO者; ② 符合MA诊断标准者, MA诊断依据国际头疼协会2018年制定的《国际头痛分类指南(第3版)》[6]; ③ 临床资料无缺失者。排除标准: ① 罹患有Fallot四联症、室间隔缺损等先天性心脏病者; ② 其他病因引起的继发性MA者; ③ 合并肝、肾等重要脏器功能衰竭者; ④ 妊娠期和哺乳期患者。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 分组

86例确诊PFO患者根据临床症状不同分为2组: 合并MA组(共46例,合并有MA)、未合并MA组(共40例,确诊未合并有MA)。此外,同时期选取40例健康体检者作为对照组。3组研究对象的年龄、性别比、体质量指数、吸烟史、饮酒史、先天性心脏病家族史等资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

1.3 NTRK3基因检测

分离外周血单个核细胞: 自肘静脉抽取3 mL外周血,置于抗凝试管中,在分离白细胞后,应用红细胞裂解液去除红细胞,混匀静置约15 min后,以250 g离心5 min, 弃上清液取沉淀,予以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。

RNA提取与cDNA合成: ① 将含有核细胞的Trizol提取液种,加入150 μL氯仿混匀,置于4 ℃环境, 5 min后离心,上清液保留。② 在上清液中加入异丙醇后混匀,冰浴10 min离心, PBS洗涤3遍,沉淀保留。③ 将沉淀加75%乙醇,振荡离心,吸除上清液,离心,再次吸出上清液, 65 ℃下烘干。④ 加入RNase-free水溶解沉淀。⑤ 使用紫外分光光度计对吸光度值进行检测,测定总RAN浓度。⑥按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA, -70 ℃保存备用。

mRNA表达: 以GAPDH作为内参,进行聚合酶链反应(PCR)扩增。反应体系总体积20 μL, 反应条件: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性10 s, 58 ℃退火60 s, 74 ℃延伸30 s, 共40个循环。通过实时荧光定量PCR检测NTRK3基因表达量,采用2-△△Ct表示。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 超声检测指标

本研究应用经食道心脏超声检查对PFO患者进行检测。患者取左侧卧位姿势,探头放置在左心房后方位置,并保持与房间隔垂直,确保房间隔清晰显示。分别于静息和Valsalva动作状态时指导患者呼气放松,重点观察孔道与左、右心房是否贯通,并完成孔道右房侧、左房侧直径与孔道直径的测定; 同时观察有无通过卵圆孔的束状彩色分流,计算孔道直径大小并进行分级,标准: ① 大定义为直径>4 mm; ② 中定义为直径2～4 mm; ③ 小定义为直径<2 mm。

分别于静息和Valsalva动作状态时,取出现微泡的左心腔内静止超声单帧图像,存在持续性分流或残余分流即为存在RLS, 分别计算静息下RLS、Valsalva状态下RLS。根据微泡数量进行分级,具体标准: ① 阴性为未发现微泡; ② 少量分流为每帧少于10个微泡; ③ 中量分流为每帧10～30个微泡; ④ 大量分流为每帧大于30个微泡。

1.5 头痛相关评分

本研究选用头痛影响测验-6(HIT-6)评分与偏头痛残疾程度评价量表(MIDAS)评分来评估PFO合并MA患者头痛程度。其中HIT-6评估患者遭受MA对生活工作以及身心健康的影响程度[7], 分值为36～78分,具体分级: ① 严重影响, >60分; ② 重大影响, >55～60分; ③ 中等影响, 50～55分; ④无影响或轻微影响, 36～<50分。

采用MIDAS评估患者遭受MA对正常生活、学习、工作能力的影响程度[8], 总分为5项分值总和,具体项目: ① 严重头痛不适导致正常生活、学习、工作效率下降显著,达50%以上; ② 严重头痛不适导致做家务效率下降显著,达50%以上; ③ 近90 d内由于严重头痛不能支持日常生活、家务; ④ 近90 d内由于严重头痛不能支持学习、工作; ⑤ 由于严重头痛无法支持生活社交活动。

1.6 随访

所有PFO合并MA患者均接受封堵术治疗,出院后予以随访,随访方式为主治医师门诊或电话随访,随访间隔为2个月,了解患者头痛缓解情况以及是否存在RLS现象,随访时间8～36个月,中位数为19个月。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 3组一般临床指标比较

3组年龄、性别比、体质量指数、吸烟史、饮酒史、先天性心脏病家族史等资料比较,差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。

表2 3组一般临床资料比较

2.2 3组NTRK3基因表达水平比较

合并MA组NTRK3基因的表达水平为(6.4±1.1), 未合并MA组为(8.2±0.8), 对照组为(10.8±1.9)。合并MA组与未合并MA组NTRK3基因表达水平低于对照组,且合并MA组低于未合并MA组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。

与对照组比较, *P<0.05; 与未合并MA组比较, #P<0.05。图1 3组NTRK3基因表达水平比较

2.3 未合并MA组和合并MA组PFO患者临床指标比较

合并MA组PFO患者静息下RLS、HIT-6评分、MIDAS评分高于未合并MA组,差异有统计学意义(P<0.05); 未合并MA组和合并MA组的PFO直径、Valsalva下RLS比较,差异无统计学意义(P>0.05), 见表3。

表3 未合并MA组和合并MA组临床指标比较

2.4 PFO合并MA患者的临床指标与NTRK3基因表达水平的相关分析

Spearman相关分析结果显示,NTRK3基因表达水平与PFO合并MA患者静息下RLS、HIT-6评分、MIDAS评分存在负相关(P<0.05), 见表4。

表4 PFO合并MA患者临床指标与NTRK3基因表达水平的相关性分析

2.5 PFO合并MA患者预后结局影响因素的Logistic回归分析

以PFO合并MA患者随访临床症状消除为因变量,以年龄、先天性心脏病家族史、NTRK3基因表达水平、PFO直径、静息下RLS、Valsalva状态下RLS、HIT-6评分、MIDAS评分为自变量,进行多元Logistic回归分析。结果表明,NTRK3基因表达水平是PFO合并MA患者随访临床症状消除的保护性因素(OR=0.621,P=0.018), 见表5。

表5 PFO合并MA患者预后结局影响因素的Logistic回归分析

3 讨 论

PFO患者MA患病率显著高于普通人群,在行封堵术后患者MA发生频率以及程度一般均显著改善, PFO与MA存在相关性已得到临床公认[2],但其具体病理生理机制仍尚不明确,目前较认可的机制分析为PFO患者存在RLS现象,使静脉微栓子进入体循环,导致反常栓塞,在脑皮质中引起缺血微梗死,使得炎性因子扩散到三叉神经等部位引起头痛[9]; 同时循环中炎性因子以及某些代谢产物也与微栓子一起,避过肺循环代谢,从而导致脑小动脉闭塞,引起低灌注致使头痛发作[10]。PFO是一种常见的先天性心脏病,因此其发病与基因突变和表达程度变化相关。既往研究[11]报道,单纯PFO合并散发性偏瘫性MA的患者遗传基因分析显示存在ATP1A2基因突变,这提示PFO合并MA患者可能确实存在某些基因表达的改变,但是具体基因改变尚不明确。

NTRK3基因编码一种神经营养因子受体。既往研究[12-13]显示, NTRK3蛋白不仅在正常的神经反射中发挥重要作用,而且在肺癌、肝癌等多种癌症发展转移中也起到重要作用。目前,根据蛋白质互作网络验证,NTRK3与PLAG1、PI3等多种蛋白质编码基因存在相互作用,能够通过直接调节多种生长因子干预细胞增殖过程,因此在胚胎发育和肿瘤发生中具有重要作用[14]。近年来,国外实验动物研究[15]显示,NTRK3敲除小鼠会导致一系列与人的心脏发育畸形相似的圆锥动脉干畸形,如Fallot四联症、肺动脉狭窄以及心内膜管形成异常等。国外研究[16]显示,NTRK3基因在转录以及蛋白水平的表达程度降低是Fallot四联症的发生机制之一,这表明NTRK3基因在神经系统和心脏的发育中也具有重要效应。然而PFO患者体内NTRK3基因的表达水平变化相关临床报道较少,因此本研究将NTRK3基因作为目标基因,分析PFO合并MA患者临床指标以及接受封堵术后症状消除与NTRK3基因表达水平的相关性,以为进一步在分子生物层面探讨PFO合并MA发病机制提供新的思路。

为排除非研究因素对研究结果的干扰,本研究通过筛选研究对象,确保年龄、吸烟史、饮酒史以及先天性心脏病家族史等因素之间没有差异,保证结果可靠性。本研究以临床是否合并有MA为标准,将PFO患者分组,并以普通体检者为对照,结果显示合并MA的PFO患者NTRK3基因表达水平最低,且正常体检者NTRK3基因表达水平均高于PFO患者,这提示NTRK3基因表达水平与PFO合并MA患者存在相关性。进一步分析2组PFO患者的临床指标, 2组PFO直径无差异,提示是否合并MA与PFO直径没有显著相关性。合并MA的PFO患者静息下RLS显著较高,而Valsalva状态下RLS无显著差异,这提示静息时RLS对MA发生频率与程度存在相关性。而本研究发现, PFO合并MA患者NTRK3基因表达水平与静息下RLS存在负相关,这可能是患者静息下RLS的基因层面发病机制之一,值得今后进一步予以关注研究。通过多元Logistic回归分析被证实,NTRK3基因表达水平是PFO合并MA患者随访临床症状消除的保护性因素,这说明临床可以通过分析患者NTRK3基因表达水平来预测封堵术后的临床症状改善情况。

综上所述, PFO合并MA患者的NTRK3基因表达水平降低,与患者重要临床指标和封堵术后预后均有显著相关性,这为PFO合并MA患者今后的临床诊治提供了新思路。但本研究也有不足之处,未对NTRK3基因下游信号传导通道以及引起的生物学变化与PFO合并MA进行详细探讨,封堵术后PFO合并MA患者长期NTRK3基因表达情况尚不能确定,还有待进一步分析PFO合并MA患者NTRK3基因与其他基因的相互作用。