BCG感染对小鼠肺组织中NLRP3炎性小体相关分子表达的影响

苗申奥, 聂雪伊, 马伯利, 徐金瑞, 杨 易

(宁夏大学 生命科学学院,宁夏 银川 750021)

结核病是一种病变主要发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的慢性传染病. 2020年全球约有130万人死于结核病[1].结核分枝杆菌(Mycombacterium tuberculosis,Mtb)的主要宿主细胞是巨噬细胞,当Mtb感染巨噬细胞会影响巨噬细胞凋亡并活化多种细胞因子表达,引发一系列炎症反应.炎症对早期抑制结核分枝杆菌的繁殖与传播有积极作用,但过量的炎症因子表达也会造成肺组织损伤,破坏肺功能.炎性小体相关分子的表达与肺结核病的发生和发展密切相关.炎性小体(inflammasome)是指通过应激、组织损伤和细胞内感染等途径激活的多蛋白复合物,是先天免疫系统中的一部分.研究表明,结核分枝杆菌感染的进程与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing three,NLRP3)和黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)的炎性小体有关[2].NLRP3的结构和功能是目前研究较清楚的炎性小体.NLRP3被激活后,信号转导通路使IL-1β,IL-18等促炎细胞因子有效释放,引发炎性反应和细胞焦亡[3].针对肺结核的研究主要集中在结核病检测、治疗和耐药方面,对疾病的发生机制研究较少,尤其是关于免疫机制的研究.牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是预防结核病的减毒活疫苗,除了用于预防结核病外,还常用于炎症疾病研究.研究发现,从BCG感染的巨噬细胞中提取的凋亡囊泡,对结核病有较好的预防、控制作用[4].因此BCG感染后引起的免疫反应机制研究具有重要意义.笔者以BCG感染小鼠为例,对小鼠肺组织中NLRP3炎性小体相关分子进行检测,探究BCG感染对小鼠肺组织炎性病变及NLRP3炎性小体相关分子表达水平的影响,为结核病的发生、发展机制研究提供参考,并为结核病的预防提供新思路.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);Trizol试剂(美国Ambion公司);qRT-PCR检测试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司);BCA蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);M-PER蛋白裂解液(美国Thermo Fisher Scientific公司);Protease inhibitor Cocktail蛋白酶抑制剂(美国Sigma-Aldrich公司);一抗为兔抗鼠β-actin单克隆抗体(美国Proteintech公司);兔抗鼠NLRP3单克隆抗体、兔抗鼠ASC单克隆抗体、兔抗鼠Caspase1单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司);兔抗鼠Caspase11单克隆抗体(美国Abcam公司);二抗为荧光素偶联的羊抗兔IgG抗体(美国Proteintech公司).

实时荧光定量PCR仪(Quantity Studio 5,NanoDrop-8000,美国Thermo Fisher Scientific公司);Amersham Imager600自动化学发光成像仪(美国General Electric Company公司);Enspire荧光酶标仪(美国Perkin Elmer公司).

1.2 材料

五周龄C57BL雌性小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司),BCG(成都生物制品研究所).

1.3 BCG感染实验

对饲养一周的小鼠进行随机分组,分为BCG组与对照组,两组均为3只.BCG感染组经气管滴注50 μL的BCG菌液(4.5×106CFU/只),对照组经气管滴注相同体积的PBS缓冲液.两组小鼠在温度为25℃、湿度为50%的环境下饲养.每天观察小鼠状态,保证饲料与水充足.每周更换垫料,并清洗饲养笼及饮水瓶.28 d后处死小鼠,摘取小鼠肺组织用于后续实验.

1.4 肺脏组织学观察

取完整肺脏置于PBS缓冲溶液中冲洗,洗掉表面血液.用φ=4%甲醛溶液固定24 h.依次进行脱水、包埋、切片和HE染色.在光学显微镜下观察组织的形态学.

1.5 Western Blot实验检测NLRP3相关分子的表达

将两组小鼠的肺组织分别置于加有磁珠的1.5 mL离心管中,加入0.5 mL裂解液,置于液氮低温粉碎机破碎至无明显组织残留.于4 ℃,14 000 r/min离心分离15 min,收集上层清液.通过BCA 检测试剂盒测定蛋白的浓度,然后定量加入缓冲液,置于沸水浴中5 min,在-20 ℃下保存备用.30 μg蛋白经SDS-PAGE 电泳,湿转至PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的TBS试剂于室温封闭2 h,再用TBS试剂洗涤3遍.4 ℃过夜孵育提前稀释好的β-actin,NLRP3,ASC,Caspase1,Caspase11一抗,分别用TBST,TBS洗涤3遍;室温孵育二抗2 h,分别用TBST,TBS洗涤3遍.加入化学发光液(ECL),通过化学发光检测仪(GE)检测并记录蛋白条带.

1.6 qRT-PCR实验检测NLRP3相关分子的转录

Trizol法提取小鼠肺组织中mRNA,按照逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA.再按照qRT-PCR试剂盒说明书加入引物、Buffer缓冲液、无核酸酶水及cDNA.混匀后进行PCR扩增反应,通过2-ΔΔct法对扩增结果进行分析.所用引物为自主设计(表1).

表 1 qRT-PCR实验所用引物

1.7 数据分析

数据均进行3次独立实验验证,使用GraphPad Prism 7.0进行数据分析.

2 结果

2.1 BCG感染后肺组织的病理学改变

收集小鼠肺组织HE染色切片(图1).与对照组相比,BCG感染组的肺组织明显充血,并伴有肺泡间隔消失,有类上皮细胞增生和炎性细胞浸润出现,表明BCG感染引起小鼠肺组织炎症病理损伤.

图1 BCG感染后肺组织病理学的变化(HE染色,放大400倍)

2.2 BCG感染后NLRP3等蛋白表达水平

Western Blot实验检测结果表明(图2):BCG感染组中的NLRP3炎性小体成分(NLRP3,ASC,Caspase-1),与Caspase-11蛋白的表达水平较对照组上调,为差异极显著(P<0.01).

图 2 BCG感染后NLRP3等蛋白的表达水平

2.3 BCG感染后NLRP3等转录水平的变化

qRT-PCR实验结果显示(图3):与对照组相比,BCG感染组中的NLRP3,ASC,Caspase-1,Caspase-11的mRNA转录水平均显著增高(P<0.01).

图3 BCG感染后NLRP3等的mRNA转录水平变化

3 讨论

目前,卡介苗是世界卫生组织(WHO)唯一批准使用且可有效预防结核病的疫苗.由于卡介苗的防预效果并不十分理想,并且随着人口流动增加、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现[5],全球结核病疫情回升,特别是新冠感染大流行对结核病的防治有很大的影响[1].因此,对有效的结核病疫苗和新型检测手段的需求越来越迫切.目前,结核病疫苗的研发主要致力于对BCG进行改造及开发新型疫苗,如亚单位疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗等[6].通过基因工程技术等手段改造BCG可产生不同的BCG突变株,这是一种十分有效的方式,目前研发的rBCG(mbt)30,rBCG(panCD)30[7],rBCG[8]等已取得很大进展.对于新型疫苗的研发,重点是寻找更安全、有效的抗原和新的靶点.无论从何种角度考虑,都需对结核病的免疫机制有更多的了解,但目前对于BCG引起的机体免疫机制研究还没有系统的报道.

肺泡巨噬细胞作为结核分枝杆菌入侵机体肺组织的主要宿主细胞,也是机体免疫系统的重要组成部分.在结核分枝杆菌感染的起始阶段,巨噬细胞可吞噬并抑制结核分枝杆菌的生长.当成功抵抗巨噬细胞的攻击后,结核菌在未活化的巨噬细胞内大量增殖,逐渐使巨噬细胞分化、聚集.待组织出现干酪样坏死时,被侵染的巨噬细胞被机体免疫机制杀灭,释放出大量的结核菌.在引发炎性因子释放的同时,结核菌入侵其他组织细胞(如纤维细胞、淋巴细胞和上皮样细胞等).这一系列变化使组织病理不断加重、病变范围扩大,最终形成组织空洞[9].该研究中经气管滴注BCG的方法感染小鼠,造成小鼠肺组织的免疫病理损伤.梁粟等使BCG感染C57BL小鼠,造成小鼠肺组织出现单核淋巴细胞浸润并呈现灶性分布、局灶上皮脱失、肺泡间隔弥散增宽及肺泡毛细血管扩张淤血等病理变化[10],这与本文的研究结果一致.

HE染色实验的结果显示,BCG感染与结核分枝杆菌感染的结果相同.Western Blot实验结果显示,BCG感染组中的NLRP3炎性小体相关蛋白表达量增加.qRT-PCR实验也验证了这一结果.对于结核菌感染后NLRP3炎性小体活化的确切机制问题,目前还没有定论,主要有3种观点[11]:一是与结核菌的ESX-1系统有关.ESX-1系统在结核菌抵抗机体清除功能的免疫逃逸机制中发挥关键作用[12].但作为减毒株的BCG,与结核菌相比,其显著特点是基因组中缺失了RD1区,而ESX-1相关基因就位于RD1区[13].二是破损组织的细胞内容物释放到细胞质中引起NLRP3炎性小体活化.三是由线粒体活性氧引起的.该实验结果显示,在BCG感染后,小鼠肺组织中Caspase-11的表达上调.TLR/TRIF/IRF通路也是炎症介质的典型通路,研究表明,TLR/TRIF/IRF通路能激活Caspase-11并进一步激活NLRP3炎性小体[14].NOD,RIP2通过对ROS的调节来激活Caspase-11,随后进一步引起NLRP3炎性小体活化[15].研究显示[16-17],Caspase-11激活后会破坏细胞膜的结构造成钾离子外流,引起NLRP3炎性小体活化,这与结核菌ESX-1系统激活NLRP3炎性小体的原理相似[18].当机体出现炎症时,激活的信号通路不止1条,且各信号通路间都相互交联,这也是结核病研究的难点之一.BCG感染后,Caspase-11与NLRP3炎性小体究竟如何激活及其两者之间的联系,还有待进一步的深入研究.

4 结论

BCG感染C57BL小鼠,引起与结核分枝杆菌感染相似的免疫病理损伤,并诱导NLRP3炎性小体的表达量增加.同时,NLRP3炎性小体与Caspase-11蛋白之间可能存在交联应答的关系.