气相色谱法测定中、长链脂肪乳注射液中大豆油和中链甘油三酸酯含量的不确定度评定

陈蓉，马冬阳，顾晓风

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215104）

肠外营养制剂中、长链脂肪乳注射液是目前临床最为常用的脂肪乳剂之一，广泛应用于直肠癌术后、大面积烧伤等疾病所致的吸收不良或无法进食的重症患者，有助于胃肠功能恢复及机体营养吸收，提高机体免疫力，减少炎性因子释放，减轻炎症反应[1]。中、长链脂肪乳注射液为大豆油(LCT)和中链甘油三酸酯(MCT)按相等的质量比混合，经均质、灌装、灭菌制成的无菌注射用乳剂[2]。中/长链脂肪乳注射液的主要成分大豆油能阻断网状内皮系统，干扰T、β 淋巴细胞功能，阻碍其损害吞噬细胞；中链甘油三酸酯可直接进入线粒体，有较快的氧化速率和血浆清除率，不易在体内蓄积[3]。相比其它乳剂，中、长链脂肪乳中的营养配比更接近于人类脂肪酸比例[4]。

测量不确定度是表征被测量值的分散性与测量结果相关性的参数[5]，是定量分析结果的重要组成部分，可用于评估定量检测方法的可靠性和测量结果的可信度。测量结果的不确定度越小，其可靠性越高[6]。在药品检验过程中，当测量结果出现临界值或需要建立和确认非标准方法时，不确定度评定具有重要意义[7]。在考虑实验室检测能力范围及可接受风险程度的基础上，应适当收窄测量不确定度的范围，以避免可能出现的风险[8]。

目前有关中、长链脂肪乳注射液含量测定方法的文献较少[9-11]，且未见其不确定度评定的报道。为获得准确可靠的量化数据，以确保中、长链脂肪乳注射液的有效性水平可靠，笔者根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[12]、JJF 1135—2015《化学分析测量不确定度评定》[13]及CNAS GL 006—2019《化学分析中不确定度的评估指南》[14]，并参考文献[15-19]，对气相色谱法测定中、长链脂肪乳注射液中大豆油和中链甘油三酸酯含量的不确定度进行评定。通过建立数学模型，系统分析了不确定度来源和影响因素，计算各不确定度分量，最终计算出测量结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。该评定方法有助于检验人员评定测量结果的可靠性，开展测量结果之间的比对，从而提高药品的质量控制水平和实验室风险控制水平，提高实验室内部质量控制能力，改进质量管理体系[20]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B 型，配Agilent Open Lab Acquisition 2.4工作站，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：Mettler-Toledo XS205DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

电热鼓风干燥箱：BINDER OMS180型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

超声波清洗仪：SK5200HP型，上海科导超声仪器有限公司。

叔丁基甲醚：色谱纯，批号为163704，美国赛默飞世尔科技公司。

无水硫酸钠：分析纯，批号为20171120，国药集团试剂有限公司。

氢氧化三甲基锍：分析纯，批号为C11928934，美国麦克林公司。

LCT 对照品：批号为0003035312，质量分数为99.5%，贝朗医疗(苏州)有限公司。

MCT 对照品：批号为201207，质量分数为99.9%，贝朗医疗(苏州)有限公司。

α-维生素E：批号为LRAC1811，质量分数为99.0%，美国西格玛奥德里奇公司。

十一酸甲酯：批号为BCCD3600，质量分数为98.9%，美国西格玛奥德里奇公司。

中、长链脂肪乳注射液样品：批号为2202187101，贝朗医疗(苏州)有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent HP-Innowax 石英毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：程序升温，100 ℃恒温5 min，再以15 ℃/min的速率升温至205 ℃，维持18 min；进样口温度：250 ℃；进样方式：分流进样，分流比为5∶1；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：275 ℃；载气：高纯氮气，流量为2 mL/min；进样体积：1 μL。

1.3 溶液制备

内标溶液：取十一酸甲酯约120 mg、α-维生素E约0.25 mL，置于100 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚溶解并定容至标线，摇匀。

混合对照品溶液：称取LCT、MCT 对照品各40 mg，精密称定，置于具塞试管中，精密加入内标溶液10 mL，摇匀；精密量取0.1 mL，置于进样瓶中，加入氢氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL，密封，摇匀，于70 ℃加热45 min，放冷。取1 μL 注入气相色谱仪中，记录色谱图，计算校正因子(F)。

样品溶液：取中、长链脂肪乳注射液样品约0.4 g，精密称定，置于具塞试管中，精密加入内标溶液10 mL，超声15 min，放冷；加入无水硫酸钠1.5 g，摇匀，放置45 min；精密量取上清液0.1 mL，置于进样瓶中，加入氢氧化三甲基锍0.05 mL、叔丁基甲醚0.5 mL，密封，摇匀，于70 ℃加热45 min，放冷。取1 μL注入气相色谱仪。

1.4 实验方法

取混合对照品溶液和样品溶液各1 μL，按照1.2色谱条件进样测定，以色谱峰面积内标法定量。

1.5 数学模型

按照式(1)～式(4)计算校正因子F及样品中LCT、MCT含量：

式中：F1——LCT校正因子；

Ai——混合对照品溶液中内标十一酸甲酯的色谱峰面积；

m1——LCT对照品的质量，g；

ws1——LCT 对照品的纯度(质量分数)，ws1=99.5%；

A1——混合对照品溶液中LCT 色谱峰面积，为棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯与亚麻酸甲酯的色谱峰面积之和；

F2——MCT校正因子；

m2——MCT对照品的质量，g；

ws2——MCT 对照品纯度(质量分数)，ws2=99.9%；

A2——混合对照品溶液中MCT 的色谱峰面积，为辛酸甲酯与癸酸甲酯的色谱峰面积之和；

ρLCT——样品溶液中LCT的质量浓度，g/mL；

Ax1——样品溶液中LCT 的色谱峰面积，为棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯与亚麻酸甲酯的色谱峰面积之和；

ρ——对照品溶液质量浓度，g/mL；

Axi——样品溶液中内标十一酸甲酯的色谱峰面积；

m——样品质量，g；

ρMCT——样品溶液中MCT的质量浓度，g/mL；

Ax2——样品溶液中MCT 的色谱峰面积，为辛酸甲酯与癸酸甲酯的色谱峰面积之和。

2 不确定度分量

根据实验方法和数学模型，气相色谱法测定中、长链脂肪乳注射液中LCT和MCT含量的不确定度分量包括：(1) LCT、MCT对照品纯度引入的不确定度；(2) LCT、MCT对照品溶液配制过程(包括对照品称量、溶液稀释、衍生化反应)引入的不确定度；(3)样品溶液配制过程(包括样品称量、溶液稀释、衍生化反应)引入的不确定度；(4)重复测定引入的不确定度。

基于内标法的特点，对照品和样品溶液配制均直接以内标溶液作为溶剂，均与同量衍生化试剂在相同温度下反应相同时间，故与内标十一酸甲酯配制浓度、抗氧化剂α-维生素E用量、衍生化试剂氢氧化三甲基锍等均无关，以上因素可不予评定。

3 不确定度的评定

3.1 对照品纯度引入的不确定度

根据企业提供的标准物质证书，LCT和MCT对照品的纯度(质量分数)分别为99.5%、99.9%，暂无不确定度的相关信息，可假定其分散区间的半宽度为0.05%[21-22]，则对照品纯度引入的标准不确定度[23]：

则对照品纯度引入的相对标准不确定度：

3.2 对照品溶液配制过程引入的不确定度

3.2.1 对照品称量引入的不确定度

根据电子天平检定证书，所用天平最大允许误差为±0.1 mg，为B 类测量不确定度[24]，根据矩形分布，取k= 3，则由天平最大允许误差引起的标准不确定度

LCT、MCT对照品称样质量ms均为40 mg，因此由对照品称量引入的相对标准不确定度：

3.2.2 对照品溶液稀释引入的不确定度

对照品稀释过程中仅使用了A级10 mL单标线移液管1 次。根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》规定，在20 ℃条件下，其最大允差为±0.020 mL[25]，依据B 类评定规则，按矩形分布计算，取k= 3，则由10 mL单标线移液管容量允差引入的标准不确定度

在(20±5) ℃进行溶液配制，叔丁基甲醚的体积膨胀系数为0.001 46 ℃-1[26]，则体积变化为10×0.001 46×5=0.073 (mL)，按照均匀分布考虑，取k= 3，则由温度变化引入的标准不确定度：

因此，10 mL 单标线移液管引入的标准不确定度：

其相对标准不确定度：

3.2.3 对照品衍生化反应溶液配制引入的不确定度

衍生化操作步骤分别使用了100、50、1 000 μL移液器。根据JJG 646—2006《移液器检定规程》[27]的规定，100 μL 移液器容量允许误差为2.0%，按照均匀分布考虑，取k= 3，则由容量误差引入的标准不确定度：

参照3.2.2 评定温度变化引入标准不确定度分量：

由100 μL移液器引入的标准不确定度：

其相对标准不确定度：

同法评定，得50 μL (允许误差为3.0%)、1 000 μL (允许误差为1.0%)移液器引入的相对标准不确定度urel(V50)=0.346 446，urel(V1000)=0.007 149。

则由对照品衍生化反应溶液配制引入的相对标准不确定度：

综上所述，由对照品溶液配制过程引入的相对标准不确定度：

3.3 样品溶液配制过程引入的不确定度

3.3.1 样品称量引入的不确定度

样品称量操作与对照品一致，称取质量为0.4 g，参照3.2.1评定，得样品称量引入的相对标准不确定度urel(mx)=0.000 144。

3.3.2 样品溶液稀释引入的不确定度

样品稀释过程与对照品一致，参照3.2.2 评定，得样品溶液稀释引入的相对标准不确定度urel(V10)=0.004 37。

3.3.3 样品衍生化反应溶液配制引入的不确定度

样品衍生化过程与对照品一致，参照3.2.3 评定，得样品衍生化反应溶液配制引入的相对标准不确定度urel(Vx，R)=urel(Vs，R)=0.365 306。

综上所述，由样品溶液配制过程引入的相对标准不确定度：

3.4 重复测定引入的不确定度

按1.3 方法平行制备3 份样品溶液，依次检测，用内标法计算LCT、MCT的含量，以质量分数表示，结果见表1。

表1 样品测定结果

取k= 3，则由样品重复测定引入的相对标准不确定度：

3.5 合成相对标准不确定度和扩展不确定度

各相对标准不确定度分量汇总见表2。

表2 相对标准不确定度分量汇总

以上4 个不确定度分量彼此独立不相关，合成相对标准不确定度按式(5)计算：

将表2 数据带入式(5)，计算得大豆油和中链甘油三酸酯的合成相对标准不确定度：

合成标准不确定度：

测量结果符合正态分布，当包含概率为95%时，取扩展因子k=2，则扩展不确定度：

3.6 测定结果表示

气相色谱法测定中/长链脂肪乳注射液中LCT和MCT 含量结果表示为wLCT=(9.63±0.10)%，k=2；wMCT=(10.00±0.11)%，k=2。

4 结语

采用气相色谱内标法测定中、长链脂肪乳注射液中MCT 和LCT 的含量，并对测量结果进行不确定度评定，得出MCT 和LCT 测定结果的扩展不确定度分别为ULCT=0.10%，UMCT=0.11%。由评定结果可知，由对照品溶液和样品溶液配制过程引入的不确定度分量对最终结果的不确定度贡献最大，两个分量贡献值之和在两个组分中均高达99.8%，而标准物质纯度和样品重复测定引入的不确定度分量影响甚微。对照品和样品溶液制备中主要涉及到称量过程使用的电子天平、稀释过程使用的移液管、衍生化过程使用的移液器引入的不确定度，其中衍生化反应引入的相对标准不确定度(0.365 277)要远大于稀释过程(0.004 37)和称量过程(对照品0.001 443，样品0.000 144)，表明移液器对测定结果的影响大于移液管和电子天平，因此，在实际测定过程中，应当尽可能保证移液器的准确性，按要求进行检定。同时关注精密量器如电子天平、小容量玻璃仪器的定期计量、期间核查、性能确认等。还需要确保实验室环境状态良好，规范实验人员操作，尽量减小随机误差，使称量不确定度值尽可能降低。