宫颈鳞癌中UBQLN-1的表达及其与高危HPV感染的相关性分析

张俊俊 王 焱

河南科技大学第一附属医院妇科,河南省洛阳市 471003

宫颈癌(Cervical Cancer)是女性常见的恶性肿瘤之一,宫颈组织从正常发展成癌性病变是一个长期复杂的过程,且需要多基因、多环节的共同参与。目前高危HPV的持续感染是导致宫颈癌发生的主要病因,但宫颈癌的具体发病机制尚不清楚,因此寻找有效的防治方法仍是临床医生面临的重大难题。泛素蛋白-1归属于泛素样蛋白家族,具有保持细胞内蛋白质稳定的作用,可通过调节蛋白质的降解、抑制细胞凋亡、促进上皮—间质转化等机制参与恶性肿瘤的发生发展过程。近年研究显示[1],UBQLN-1 参与了多种肿瘤的发生进展过程;但目前关于UBQLN-1在宫颈癌中的研究比较少见,且UBQLN-1与高危HPV感染相关性的研究目前尚未发现。本文通过免疫组化SP法检测UBQLN-1在不同宫颈病变组织中的表达情况,探索其与高危HPV感染的关系及与宫颈鳞癌发生、发展及预后的关系,为宫颈癌的防治及预后评估提供新的生物学指标。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2015年4月—2016年8月来自我院经手术切除或活检的宫颈组织180例,其中宫颈鳞癌84例(宫颈鳞癌组),CINⅠ31例(CINⅠ组), CINⅡ～Ⅲ 39例(CINⅡ～Ⅲ组),以及因子宫肌瘤或腺肌病行子宫全切的正常宫颈组织26例(对照组)。84例宫颈鳞癌患者中,年龄<50岁37例,≥50岁47例;未绝经36例,已绝经48例;按2018年 FIGO分期标准分期:Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ～Ⅳ期30例;分化程度:高分化49例,中—低分化35例;淋巴结转移(54例Ⅰ～Ⅱ期患者术后经病理明确指出有无淋巴结移转的宫颈鳞癌患者):有淋巴结转移34例,无转移20例。标本取材及研究均经患者及其家属知情同意,该研究经我院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准:(1)所有研究对象术前均行 HPV-DNA检测;(2)均为初次治疗患者;(3)所有患者病例资料及随访资料完整;(4)所有患者均无合并严重的内科疾病。排除标准:(1)既往有放化疗及靶向治疗史;(2)合并有其他肿瘤病史的患者。

1.3 方法 HPV有无感染采用PCR-反向点杂交检测方法:采用HPV核酸扩增分型检测试剂盒(深圳亚能生物技术公司),按试剂盒说明书进行操作,首先吸取标本1.5ml,进行离心,后弃上清液,用试剂盒随带的DNA提取试剂提取HPV-DNA,行PCR扩增和杂交、显色及结果分析。免疫组化方法:所有收集的新鲜标本首先均经 10% 甲醛固定,进一步行石蜡包埋,后严格进行4μm 厚连续切片(所有切片均经我院病理科2位高年资主任医师统一确诊);切片后的标本玻片经严格依次脱蜡、水化等处理,滴加一抗,采用Envision法进行免疫组化染色,实验步骤严格按试剂说明书操作,该研究所用的UBQLN-1抗体(1∶100)购于abcam公司;二抗试剂盒购于北京中杉金桥技术有限公司。以PBS缓冲液作为阴性对照。

1.4 结果判断 UBQLN-1在宫颈组织中的阳性染色主要定位于细胞的胞质及胞核中,以出现棕色为阳性表达;其表达情况主要根据阳性细胞着色强度和细胞数评分:无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别计为0、1、2、3分;每个高倍镜视野计数100个细胞,随机观察10个视野,取其平均值作为阳性细胞数,按照<10%、10%～40%、41%～70%、>70%分别为0、1、2、3分;将两项得分结果相乘的结果作为最终评分,≤3为阴性,>3为阳性[2]。

1.5 随访 医院或电话定期随访宫颈鳞癌患者病情及预后,随访开始时间为患者确诊住院时间,截止时间为2021 年 8 月31日;总生存期(OS)为患者确诊住院开始治疗时间至随访停止时间或死亡。

1.6 统计学方法 采用 SPSS23.0软件分析数据,计数资料采用百分率(%)表示,组间比较采用χ2检验;相关性分析采用Spearman相关性系数表示;生存曲线采用Kaplan-Meie 法绘制,比较采用Log-rank χ2检验 ;预后影响因素用Cox 比例风险模型,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UBQLN-1在不同病变宫颈组织中的表达 UBQLN-1在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌组织中的阳性率逐步升高,组间比较差异具有统计学意义(χ2=59.672,P<0.05),见表1。

表1 UBQLN-1在不同病变宫颈组织中的表达

2.2 UBQLN-1表达与宫颈鳞癌临床病理特征的关系 宫颈鳞癌中UBQLN-1的阳性表达与年龄、是否绝经及有无淋巴结转移无关(P>0.05),而与临床分期、分化程度有关(P<0.05),见表2。

表2 UBQLN-1表达与宫颈鳞 癌临床病理特征的关系

2.3 高危 HPV在不同病变宫颈组织中的感染情况 高危 HPV 在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌组织中的感染率逐步升高,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 高危HPV在不同病变宫颈组织中的感染情况

2.4 UBQLN-1表达与高危HPV感染的相关性分析 通过 Spearman 相关性分析结果显示随着宫颈病变的进展,UBQLN-1 在不同病变宫颈组织中的表达与高危 HPV 的感染呈正相关(P<0.05), 见表4。

表4 UBQLN-1表达与高危HPV感染的相关性分析

2.5 UBQLN-1 在宫颈鳞癌中的表达与预后的关系 84例宫颈鳞癌患者的中位OS为 65.98个月,95%CI为61.98～69.99个月。UBQLN-1的阳性表达与OS的缩短相关,差异有统计学意义(χ2=4.629,P=0.031),见图1。以OS作为因变量,UBQLN-1的表达、临床分期、分化程度作为自变量进行多因素 Cox比例风险分析,结果显示UBQLN-1的表达、临床分期为宫颈鳞癌OS的独立影响因素(P<0.05),见表5。

图1 UBQLN-1在宫颈鳞癌中的表达与总生存期的关系

表5 宫颈鳞癌OS的影响因素分析

3 讨论

目前随着HPV疫苗及宫颈癌筛查的普及,部分宫颈癌患者得以早期预防及治疗;但临床宫颈鳞癌的发病率仍较高且对于已治患者仍存在较大的复发风险,而对于复发及晚期宫颈癌患者目前尚无有效的治疗方式。因此寻求新的有效的防治和预后评估的手段显得尤为重要。

UBQLN-1是由11 个外显子组成的一种核小体表面蛋白,归属于泛素蛋白家族,其编码基因位于人类染色体 9q22,保守性较强,可编码 561 或 589个氨基酸序列;其具有3个功能域,包括C端泛素相关结构域(UBA)、N端泛素样结构域(UBL)和STI伴侣结构域。UBQLN-1可通过多种机制参与恶性肿瘤的发生发展过程,具体如下:(1)UBQLN-1可通过其结构域作为一种传递蛋白发挥作用,UBL可介导泛素与蛋白酶体19S亚基的S5A组分的泛素受体以及UbA相互作用,进而使UBQLN-1通过连接泛素化机制和蛋白酶体调节蛋白酶体的降解[3-4];(2)UBQLN-1可通过促进Survivin表达和抑制p53的表达抑制细胞凋亡[5];(3)UBQLN-1可通过多种信号通路促进上皮—间质转化,诱导肿瘤细胞的发生发展[6]。

2020年谢光琴等[7]的研究显示UBQLN1可通过增强食管癌细胞中N-cadherin、Vimentin的表达,同时抑制E-cadherin的表达,促进上皮—间质转化的发生降低食管鳞癌细胞间黏附力,增强胞间移动性,进而促进食管癌的侵袭和迁移。胡潺潺等[5]的研究发现抑制UBQLN1的表达可上调p53的表达,诱导细胞凋亡,抑制乳腺癌的发生。目前关于UBQLN-1 在宫颈癌中的研究较少,直到2021年王丽娜等首次[2]发现UBQLN-1 在宫颈癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织,且与预后显著相关;由此说明UBQLN-1 可能与宫颈癌的形成、发展及预后有关。本文结果显示,UBQLN-1 在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌中的阳性表达率逐步升高,且在宫颈鳞癌中的表达明显高于正常组织;与王丽娜等的研究结果相似,但由于实验标本数目、方法及期别限制,无法说明是否与淋巴结转移有关及对宫颈癌侵袭转移的影响。生存期影响因素分析显示,UBQLN-1 的表达与预后相关,阳性表达率越高,生存期越短;这与UBQLN-1 在乳腺癌患者中表达越高,生存期越短的结果一致。该研究还发现UBQLN-1 在宫颈鳞癌中的表达与临床分期、分化程度有关,对于分期越晚、分化程度越低的患者,其阳性表达率越高;该结果与孙光源等[8]关于UBQLN-1在直肠癌中的研究结果一致。

高危 HPV 的持续感染是导致宫颈癌发生的主要原因,其中最常见的为 HPV16、18。其HPV-DNA中与致癌性密切相关的主要是早期转录基因中的E6、E7及E5。当HPV病毒侵入机体后,其基因组可随机整合到宿主细胞 DNA 中,E6蛋白通过特异性绑合p53蛋白,使其失去活性并快速降解或表达下调,致细胞原有周期失去控制,细胞增生失控[9];同时E2基因出现缺失及断裂,致使整合细胞内E2蛋白低表达,进而减弱对E6、E7基因的抑制,使E6、E7蛋白过表达,辅以E5蛋白的表达,促进HPV细胞增殖、抑制细胞凋亡及HPV转化细胞的免疫逃逸,促使感染细胞进入永生化甚至发生癌变[10-11]。E6作为HPV的主要致癌蛋白可通过特异性绑合p53 蛋白,使其失去活性并快速降解或表达下调从而促进细胞增生,导致宫颈癌的发生;而UBQLN-1 也可通过调控 p53的表达,抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增生;两者均可调控P53发挥作用,因此猜测UBQLN-1与高危HPV感染之间可能存在某种关系,而目前关于两者相关性的研究尚无。而该研究结果发现UBQLN-1 与高危HPV的感染呈正相关,说明两者之间可能通过某种机制相互作用共同促进宫颈癌的发生及发展过程。

综上所述,UBQLN-1可能参与宫颈鳞癌的发生、进展过程,并影响预后,同时调控高危HPV的感染;为宫颈癌的临床预防、治疗及预后提供了新的生物学指标;但因该研究标本及规模有限且目前UBQLN-1在宫颈癌中的研究较少,关于UBQLN1参与宫颈癌形成及与高危HPV感染相互作用的具体机制尚不清楚,仍需要今后更多更大样本的实验研究进一步探究。