恒温实时荧光法快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的研究

牛会敏， 蒋 静， 户瀚文， 王静怡

（1. 河南省食品和盐业检验技术研究院， 河南郑州 450003；2. 河南省特殊食品工程技术研究中心， 河南郑州 450003； 3. 国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），河南郑州 450003）

胡萝卜是伞形科草本植物，因其独特的营养价值和保健作用， 常被作为食品配料用于各种饮料、糕点、面食以及功能性食品中[1-3]，尤其在婴幼儿辅助食品中，其富含的胡萝卜素能帮助婴幼儿提高视力和免疫力，抵抗病菌侵袭，促进健康成长[4]。 但胡萝卜也是一种常见食物过敏原，全世界约25%的过敏反应是由食品中的胡萝卜成分产生的[5]，我国《亚运食品安全食品过敏原标识标注》[6]列出的导致过敏反应的食品中，胡萝卜位列其中，目前关于胡萝卜过敏的报道也时有发生[7-9]。 在婴幼儿辅助食品的生产销售中，若标签标识不规范，利用掺杂掺假、以次充好谋取利益，或擅自改变产品组成，造成产品的真实属性与标签不符， 这种行为不仅涉及经济、营养价值，更直接影响婴幼儿的健康安全，引发食源性过敏反应。因此，婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的真实性检测是市场监管中亟待解决的问题。

环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的等温核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6 个区域设计4 条特异引物， 利用一种链置换DNA 聚合酶在恒温条件下即可完成核酸扩增反应[10]，缩短了检测时间，无需昂贵的温控和辅助设备且操作简单，具有简单、快速、准确等优点，可广泛应用于食品中致病微生物检测[11-12]、转基因成分鉴定、掺假肉鉴别[13]及动植物病害检测等方面。 但LAMP 扩增结果的表达方式有浊度分析法和目视荧光法，这2 种结果判断方式都需要靠检测人员肉眼去观察，结果判读受外界因素的影响较大。

基于LAMP 技术并结合实时荧光技术和恒温荧光检测设备，作者根据胡萝卜的ITS1-5.8SRNAITS2基因，设计特异性引物，建立了快速检测婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的恒温荧光PCR 方法，旨在为标签管理、食品安全监管和食品质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料从当地超市或农贸市场购买大豆、玉米、大米、白萝卜、心里美萝卜、青萝卜、水萝卜、白菜、芹菜、韭菜、花生、核桃等用于特异性试验。 不同品系的胡萝卜种子随机购自农贸市场，用于灵敏度和适应性试验。 用于验证方法实用性的样本均为单位抽检样品。

1.1.2 主要试剂植物DNA 提取试剂盒、植物内源恒温扩增试剂盒：广州迪澳生物科技有限公司产品；无水乙醇、异丙醇：市售分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器QuantStudio 7 flex 实时荧光定量PCR 仪：赛默飞世尔科技公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备及DNA 提取称取适量待测新鲜胡萝卜样品， 用已灭菌的均质杯打碎混合均匀，按照植物DNA 提取试剂盒说明书要求进行DNA 提取。 提取后的DNA 使用核酸蛋白分析仪测定A260nm和A280nm，通过A260nm/A280nm的比值确定DNA 浓度和纯度。

1.2.2 引物设计根据Genbank 上公布的胡萝卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因序列，设计并合成特异性引物， 包括2 条外引物F3 和B3，2 条内引物FIP和BIP，2 条环引物FLP 和BLP，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 胡萝卜引物序列Table 1 Primer sequences of carrot

1.2.3 恒温扩增反应使用实时荧光定量PCR 仪进行恒温扩增反应， 所有反应均设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 反应条件为：63 ℃，15 s；63 ℃，45 s，共60 个循环。 反应体系见表2。

表2 恒温扩增的反应体系Table 2 Reaction system of isothermal amplification

1.2.4 胡萝卜成分恒温实时荧光法的特异性验证试验分别提取常见农作物如粮食类：大米、大豆、玉米；坚果类：核桃、花生；蔬菜类：芹菜、白菜、韭菜、白萝卜、青萝卜、心里美萝卜和水果萝卜等的DNA 作为模板， 用1.2.3 的方法进行胡萝卜特异性恒温扩增反应。

1.2.5 胡萝卜成分恒温实时荧光法的灵敏度试验称取新鲜的胡萝卜10 g、白萝卜90 g，用均质杯充分均质混匀，制备成含胡萝卜质量分数为10%的样本，取样本10 g、白萝卜90 g，充分均质混匀，制备成含胡萝卜质量分数为1%的样本，同法，分别制备质量分数为0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%的样本，分别提取DNA 进行恒温扩增，确定胡萝卜源性成分的恒温扩增检测灵敏度。

1.2.6 胡萝卜成分恒温实时荧光法适用性试验为验证引物和方法的适用性，购买不同品系的7 种胡萝卜种子（改良八寸红、农大红芯胡萝卜、三红特选八寸参、韩红参王九寸红、豫丰红笋908、红龙特级三红七寸参、新红秀胡萝卜），以确定方法的适用范围。

1.2.7 预包装食品中胡萝卜成分恒温实时荧光法检测试验选择单位抽检的7 种食品，其中包括婴幼儿辅助食品米粉、果泥、面条等（6 种食品标签标识含有胡萝卜成分，1 种食品无胡萝卜成分标识），提取DNA，按照1.2.3 的方法进行检测，通过核对检测结果与标签标示是否相符，确定本方法检测实际样本中胡萝卜成分的能力。

2 结果与讨论

2.1 引物特异性试验

基于胡萝卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因设计的内、外及环引物对胡萝卜DNA 有显著扩增，见图1，对其他11 种常见农作物尤其是白萝卜、心里美萝卜、青萝卜等物种均无DNA 扩增，说明该引物对胡萝卜源性成分恒温扩增检测有良好的特异性，与上述物种没有交叉反应。

图1 胡萝卜恒温实时荧光特异性扩增结果Fig. 1 Results of real-time fluorescence isothermal specific amplification of carrot and others

2.2 灵敏度试验

提取含有胡萝卜质量分数为10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%样品的DNA， 分别进行恒温扩增，结果见图2。 结果显示，质量分数为10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%的样品均出现典型的“S”形扩增曲线，且随着胡萝卜质量分数增加，开始出现指数扩增的时间越短， 循环阈值（cycle threshold）越小，而0.005%和0.001%的样品未呈现典型扩增曲线，因此本检测方法对胡萝卜检测限可低至质量分数0.01%。将新鲜胡萝卜、白萝卜样品粉碎后按比例进行均匀混合，模拟实际样本的混合情况，相对于直接对DNA 进行梯度稀释，考虑了DNA提取效率的影响， 因此按质量比进行灵敏度的测试，更能准确反映检测方法的技术指标。

图2 胡萝卜恒温实时荧光灵敏度检测扩增结果Fig. 2 Results of real-time fluorescence isothermal sensitivity amplification of carrot

2.3 适用性试验

提取不同品系的7 种胡萝卜种子的DNA，按照1.2.3 的方法，对7 个样本进行检测，结果见图3。实验数据表明，7 个样本均获得典型的荧光扩增曲线， 说明建立的方法能检测出不同品系的胡萝卜，方法实用性良好。

图3 不同品系胡萝卜的恒温实时荧光检测扩增结果Fig. 3 Amplification results of different cultivars of carrot by isothermal real-time fluorescence amplification

2.4 实际样本检测

采用恒温荧光扩增方法对抽检的7 种预包装食品，其中5 种是婴幼儿辅助食品的样本进行胡萝卜成分检测，检测结果和扩增曲线见表3 和图4。 7种食品中有6 种检出胡萝卜源，标签标识有胡萝卜成分的食品均有检出，与配料表中胡萝卜成分标识结果一致，表明作者建立的恒温扩增方法可用于实际样本尤其是婴幼儿辅助食品中胡萝卜成分的检测，结果准确可靠。

3 结 语

作者设计了胡萝卜成分恒温荧光PCR 法快速检测的特异性引物和反应体系，使用多种不同植物物种进行特异性验证，证实了该方法具有较高的特异性， 且可在1 h 内检测低至质量分数0.01%的胡萝卜成分，方法灵敏度较高，采用多种不同品系胡萝卜进行适用性验证，适用性广泛且结果准确。 同时对多种不同种类的预包装食品尤其是婴幼儿辅助食品进行验证，证明该方法对成分复杂、加工程度不同的市售食品中胡萝卜成分的实际检测亦有较好的适用性。

作者利用恒温实时荧光PCR 技术，建立的胡萝卜成分快速检测的新方法，集恒温扩增、实时荧光检测、智能数据判读及实时数据同步等优势，将样品中存在的微量胡萝卜核酸，扩大转化为设备可读的荧光信号，快速检测婴幼儿辅助食品中的胡萝卜成分，为婴幼儿辅助食品的标签规范管理及过敏原成分检测提供了依据。