猪源多杀性巴氏杆菌荚膜血清PCR分型鉴定

乔晓光

（河南省长垣市农业农村局，河南新乡 453400）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，革兰氏染色阴性，球杆菌或短杆状菌，需氧或兼性厌氧，无鞭毛、无芽胞、无运动性，能够引起多种畜禽出血性败血症或传染性肺炎[1]。多杀性巴氏杆菌的血清型较多，根据其荚膜抗原差异，多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F 等5 种血清型[2]。不同血清型对宿主有不同的易感性，如多杀性巴氏杆菌血清型A 和D 型通常与猪的肺炎和胸膜炎有关，血清型B 和E 型菌株与牛出血性败血病有关[3,4]，此外多杀性巴氏杆菌血清型不同，其交叉免疫保护力较差，因此，对病原鉴定时有必要鉴定其血清型。

本研究对河南省长垣市部分养猪场发病猪采集鼻咽拭子进行多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定，并进行PCR 荚膜血清型检测和分离株对抗菌药物耐药性的检测，以期为猪多杀性巴氏杆菌病防治和疫苗研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料采集

采集长垣市部分养猪场疑似猪肺疫、猪萎缩性鼻炎病猪的鼻拭子127 份，装入含有TSB 液体的培养基收集管中，送实验室4℃保存备用。

1.2 试验材料和试验动物

胰酶大豆琼脂培养基（TSA，含有5%犊牛血清和5%脱纤维绵羊血）、酶大豆肉汤培养基（TSB）均购自天津一方科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京） 有限公司；2×Taq PCR Master Mix 由Solarbio 公司生产；抗生素药敏纸片，细菌生化反应鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。5 周龄SPF 级小鼠55 只，购自河南科技学院动物医学实验室。

1.3 细菌的分离培养

将127 份病料分别接种于含有5%犊牛血清和5%脱纤维绵羊血TSA 培养基中，37℃纯化培养24 h，然后挑取单个菌落制作涂片，对菌落分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，油镜观察细菌染色和形态特性。

1.4 生化鉴定试验

挑取纯化的分离菌落，按照细菌生化鉴定说明书分别接种于蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、硝酸盐、枸橼酸盐、麦芽糖、V-P、M-R、硫化氢、蛋白胨水、甘露醇、H2S 等细菌生化鉴定管中，37℃培养24 h，观察反应结果。

1.5 分离菌株16S rRNA 鉴定

取纯化的分离菌株，接种于含有5%犊牛血清的TSB 培养基中，摇床震荡，37℃培养24 h，按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书提取分离菌株的基因组DNA。参考朱飞舟等[5]合成细菌16S rRNA 通用引物，引物序列为：27F：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。预期扩增目的片段1 450 bp。PCR 反应体系20 μL：分离菌株DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH2O 补足至20 μL。PCR 反应程序：94℃5 min，94℃30 s，53℃30 s，72℃60 s，共35 个循环，72℃延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获取的目的片段，经回收后送中美泰和生物技术（北京）有限公司进行分离菌株16S rRNA 测序，测序结果与NCBI 数据库收录的多杀性巴氏杆菌基因组序列进行BLAST 同源性比对分析，以鉴别分离菌株种类。

1.6 荚膜血清型PCR 鉴定

参照李红婕等[6]设计的荚膜血清型特异性引物capA、capB、capD、capE、capF 序列，分别合成引物，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。除所有鉴定引物退火温度均为55℃外，其他PCR 反应体系和反应程序与上述1.5 内容相同。引物生物信息见表1。

表1 多杀性巴氏杆菌荚膜血清型鉴定引物生物信息

1.7 对小鼠的致病性试验

用无菌生理盐水稀释纯培养菌落，分光光度计测定菌液浓度，使其终浓度为1×108CFU/mL。将5 周龄SPF 昆明小鼠分成1 个对照组和10 个试验组，每组5只。试验组腹腔注射菌液0.2 mL/只，对照组注射等体积的生理盐水。观察小鼠精神状态，记录死亡时间和数量。采集死亡小鼠肝脏、肺脏、脾脏等组织器官，分离培养和革兰氏染色、瑞氏染色。

2 结果与分析

2.1 细菌染色镜检与分离鉴定

本研究共有10 株分离菌在含有绵羊血和犊牛血清的TSA 培养基上形成稍微隆起、表面光滑湿润、呈露珠状的灰白色圆形菌落（图1A）；镜检观察到分离菌革兰染色为阴性，菌体呈两极浓染的短杆状、圆形或卵圆形（图1B）。瑞氏染色镜检可见蓝色两极浓染、大小不一的短球杆菌（图1C）。

图1 A：分离菌在TSA 培养基上的菌落特性；B：革兰氏染色镜检（10×100）；C：瑞氏染色镜检（10×100）

2.2 细菌生化鉴定结果

分离菌在接种于细菌生化鉴定管培养后，生化试验结果显示上述10 株分离菌均发酵果糖、蔗糖、麦芽糖，硝酸盐、甘露醇、过氧化氢和蛋白胨水试验结果为阳性；M-R、V-P 试验结果为阴性；基本符合多杀性巴氏杆菌的生化特征。对10 株分离菌命名分别编号为CY01～CY10。

2.3 分离菌的16S rRNA 鉴定

利用PCR 扩增分离菌16S rRNA 基因获得1 条长度为1 450 bp 的特异性条带（图2），符合预期目的基因片段大小。测序结果与NCBI 数据库的猪多杀性巴氏杆菌参考菌株序列进行BLAST 同源性比对，结果显示分离菌的16S rRNA 基因序列与猪多杀性巴氏杆菌的序列相似性均为100%。结合分离菌培养特性和生化试验结果，表明这10 株分离菌为猪多杀性巴氏杆菌，其检出率为7.87%（10/127）。

图2 分离菌株荚膜血清PCR 分型鉴定电泳结果

2.4 分离菌荚膜血清PCR 分型鉴定

利用多杀性巴氏杆菌荚膜血清特异性基因引物进行PCR 鉴定（图3），结果显示有3 株分离菌株提取的基因片段中，扩增的目的条带长度约为648 bp，符合capD，占30.00%；1 株分离菌目的条带约为760 bp，符合capB，占10.00%；6 株分离菌长度约为1 050 bp，符合capA，占60.00%。

图3 10 株分离菌株荚膜血清型PCR 分型电泳结果

2.5 小鼠致病性试验结果

试验组小鼠于注射菌株后3 h 开始精神不振，呆立颤抖，8 h 后陆续出现死亡，36 h 内死亡34 只。剖检可见小鼠肝脏、肺脏等器官出血肿胀。无菌采集死亡小鼠肝脏、肺脏病料接种于TSA 培养基上，培养出的菌落形态特性以及革兰氏染色和瑞氏染色镜检结果均与上述分离菌一致。

3 讨论

猪多杀性巴氏杆菌广泛存在于养猪环境和猪体正常菌群内，是一种条件致病菌，通常在猪体免疫下降或外界环境应激作用下发病，并且与其他病原体混合协同感染猪体，增加诊断和防治的难度。目前多杀性巴氏杆菌的检测技术主要是分离鉴定、PCR、ELISA、限制性酶切分析和DNA 杂交等，其中应用较普遍、灵敏快速的是PCR 检测，而PCR 检测扩增用引物大多根据多杀性巴氏杆菌16S rDNA 确定[7,8]，16S rDNA 基因序列越来越多地用于细菌的鉴定和分类，PCR 技术是在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，以母链DNA 为模板，经过预变性、变性、退火、延伸等反应程序，体外扩增复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA[9]。

多杀性巴氏杆菌荚膜决定其致病力，不同荚膜血清型致病力存在差异，且它们之间交叉免疫保护力较弱，因此，荚膜血清分型鉴定对提高诊治效率和有效性具有重要意义。彭忠等[10]报道，当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A 型和D 型菌株。张哲玮等[11]对来自广西、湖北、内蒙古3 个地区规模化猪场中有呼吸道症状猪的口鼻拭子及组织病料进行病原菌分离鉴定。结果显示，分离得到6 株猪多杀性巴氏杆菌，其中血清A型1 株、血清D 型5 株。林星宇等[12]从四川、重庆、云南等地8 个规模化养殖场的125 份病死猪肺炎样品中，分离出11 株多杀性巴氏杆菌，其中有7 株为A 血清型（63.6%）、3 株为D 血清型（27.3%）。本研究结果显示，从河南长垣市猪群采集的127 份病料中，分离鉴定出10株多杀性巴氏杆菌，检出率为7.87%，优势荚膜血清流行株为A 型（60.00%）和D 型（30.00%），与上述学者报道结果相一致，且符合我国动物源多杀性巴氏杆菌血清型多为荚膜A 型的流行情况[13-15]。本次动物致病力试验小鼠死亡率较高，为68.00%（34/50），表明多杀性巴氏杆菌致病性较强。本研究虽然采样数量偏少，但也可以说明多杀性巴氏杆菌病在该地有一定的流行性，应引起重视。

4 小结

本研究对河南省长垣市部分猪场多杀性巴氏杆菌进行分离培养、生化鉴定、PCR 分子鉴定和荚膜血清分型，结果发现，从127 份鼻拭子样品中检测出10 株多杀性巴氏杆菌，检出率为7.87%，血清A 和D 型为当地主要优势血清型，动物试验证明分离菌株致病菌毒力较强。应加强监测，开展综合防治。