金银花源miR2911 靶向非洲猪瘟病毒基因区域分析

杜非凡 陈星宇 李 硕 张 昊 常怡悦 张自瑞 闫卫疆 肖 非 孙雪梅 盛金良 孙延鸣* 张彦兵,*

（1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2 新疆泰昆集团股份有限公司，新疆昌吉 831203）

miRNA（microRNA）是一类长约19～25 nt 的非编码RNA，具有较高的保守性[1,2]。一般miRNA 的成熟需要经过3 个阶段：在细胞核中转录得到pri-miRNA、由RNase Ⅲ-Drosha 酶剪切得到pre-miRNA、由premiRNA 运转出核进入胞浆内并成熟[3-7]。含有miRNA 引导链的RISC 与靶mRNA 的3’UTR 不完全互补配对时会阻碍靶蛋白的翻译，从而抑制目的基因的表达；miRNA 与靶mRNA 发生完全互补配对时，靶mRNA 则被AGO2 蛋白降解[8]。由于miRNA 序列、结构多样，其在生物调控及蛋白质合成方面发挥着重要作用，包括病毒细胞的增殖与凋亡、癌症治疗等方面[9,10]。

金银花是一种重要的药用植物，因为具有多种生物活性，所以在生理上主要有解热、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，其作为中药材被广泛应用于治疗流感病毒等方面[11]。2015 年Zhou 等[12]发现灌服金银花汤后的小鼠体内miR2911 丰度较高。由于miR2911 的功能在于能够靶向多种甲型流感病毒（IAVs），所以化学合成的miR2911不但可以显著抑制H1N1 的PB2 和SN1 蛋白的表达，而且还能降低H5N1 感染小鼠的死亡率。最新研究显示，miR2911 可有效抑制SARS-CoV-2（新型冠状病毒）的复制，并且miR2911 在SARS-CoV-2 基因区域存在多个抑制靶点[13]，因此，猜测金银花miR2911 可能具有较广泛的抗病毒作用。

非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种双链DNA 病毒，属于非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）。ASFV 病毒粒子直径一般可达260～300 nm，其基因组长度介于170～193 kb，可编码150～167 个蛋白。并且ASFV 是一种烈性病毒，急性期ASFV 可引起猪100%的死亡率，感染ASFV 的病猪症状包括嗜睡、血性腹泻、高热、血管变化等[14,15]。目前已研发出的非洲猪瘟灭活疫苗无法完全诱导生猪机体产生中和抗体，且效果不佳，而基因缺失疫苗正在研发中。因此，针对非洲猪瘟病毒缺乏有效的治疗手段，仍需要以防控为主。

鉴于miR2911 具有强大的抗病毒功效，本文通过生物信息学等方法，探讨金银花源miR2911 对ASFV 相关基因靶向区域，以期为研发抗ASFV 感染的药物提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 金银花miR2911 序列获得

在miRbase（http://www.mirbase.org/index.shtml）数据库中，下载金银花源miR2911 的成熟序列，5’-GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3’。

1.2 ASFV 全基因序列下载

进入NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 数据库，搜索ASFV 的全基因组序列，下载我国当前非洲猪瘟病毒流行毒株的全基因组序列。

1.3 miRNA 靶向ASFV 基因区域预测

在windows 环境下，打开网页版本的miRanda 软件（http://www.bioinformatics.com.cn/local_miranda_m iRNA_target_prediction_120），在操作界面输入miRNA序列和ASFV 全基因组序列，点击分析，则会运行程序显示分析结果。

1.4 靶向区域进化树构建

在构建miR2911 靶向ASFV 基因区域进化树时，先将每个病毒被靶向区域与其他流行毒株进行比对，从而获取不同毒株相应靶向区域。每个毒株被靶向区域按照一定顺序拼到一起，1 个毒株作为1 个整体的基因序列，利用MAGE7 软件，按照临近法构建进化树，相当于多基因法构建进化树。

2 结果与分析

2.1 miR2911 靶向ASFV 基因区域预测

利用miRanda 软件预测，首先，将miR2911 分别靶向ASFV 的NP1450L 基因、GL1340L 基因、MGF_110-5L-6L 基因及EP1242L 基因等4 个基因的2 个区域，其中对NP1450L 基因130 231～130 255 区域的靶向性较好，其分值为108 分，自由能（Energy）为-35.37 kCal/Mol。其次，miR2911 对ASFV 的G1340L 基因的112 860～112 881 区域靶向时，其分值可以达到102分，自由能（Energy） 为-25.40 kCal/Mol；在靶向ASFV 的EP1242L 基因的2 个区域（69 000～69 022 和67 435～674 54）时，区域69 000～69 022 的靶向性相对较高，其分值可达99 分，自由能可达到-32.02 kCal/Mol；靶向ASFV 的MGF_110-5L-6L 基因的10 218～10 237 区域，其分值为93 分，自由能为-23.81 kCal/Mol。综合miR2911 靶向AFSV 的4 个基因的各项数据，表明miR2911 具有潜在抑制AFSV 中NP1450L基因和ASFV G1340L 基因复制的能力（图1）。

图1 miR2911 靶向ASFV 基因分析结果

2.2 miR2911 靶向ASFV 基因区域序列进化树分析

在NCBI 数据库中，下载miR2911 靶向ASFV 基因区域序列，将多个区域按先后串联，利用MEGA 7.0 软件中邻近法构建miR2911 靶向病毒基因区域进化树，miR2911 靶向ASFV 的基因区域100%同源（图2）。

图2 miR2911 靶向ASFV 基因多区域序列进化树

3 讨论

金银花性甘、寒，具有多种生物活性，可起到清热解毒，消炎退肿的作用；金银花与其他中药配伍后可预防和治疗病毒性感染。据报道，金银花源miR2911 通过与病毒特定基因序列的相互作用，可以有效抑制病毒的复制，在抗病毒方面发挥着重要作用。在畜禽养殖过程中，抗病毒感染与治疗是当前全球范围内探讨的一个热点话题。研究表明，miR2911 性质稳定，经口服可被动物体吸收。鉴于miR2911 的抗病毒作用，以miR2911为研究对象，通过应用miRanda 软件分析miR2911 靶向ASFV 基因的具体区域、分值及自由能的高低，从而进一步分析miR2911 靶向病毒区域的保守性，以期为治疗猪病毒性传染病提供借鉴。

自2018 年非洲猪瘟疫情在我国发生以来，猪主要病毒性传染病防控形势愈发严峻，“老病未灭，新病又起”是我国目前养猪业面临的主要问题。目前病毒性传染病往往需要免疫疫苗进行防控，还没有特效治疗药物。经研究考虑到金银花源miR2911 在抵抗流感病毒感染和新型冠状病毒感染时发挥的中药作用，猜测金银花miR2911 可能在ASFV 基因上存在潜在的靶向位点，并利用miRanda 软件成功预测了miR2911 在ASFV 基因上的靶向位点。由于miR2911 在猪病毒基因上的靶向区域很多，所以将得分低于82 分的全舍弃。miR2911 可靶向ASFV 的4 个基因，其中在ASFV 的EP1242L 基因上有2 个靶向区域。

非洲猪瘟病毒中的NP1450L、EP1242L 和MGF_110-5L-6L 等3 个基因在病毒感染生猪过程中发挥重要作用。NP1450L 蛋白与RNA 聚合酶的最大亚基具有广泛的相似性。而EP1242L 蛋白类似于第2 大RNA 聚合酶亚基。NP1450L 蛋白和EP1242L 与真核RNA 聚合酶Ⅱ的亚基更相似；NP1450L 和EP1242L 主要在非洲猪瘟病毒感染晚期开始表达。外源表达MGF110-5L-6L蛋白还可诱导高尔基体和过氧化物酶体的亚细胞定位与形态发生显著改变，认为MGF110-5L-6L 蛋白可能通过影响内质网腔中氧化还原稳态、蛋白质分泌途径及相关膜性细胞器发生等，而打破细胞的正常生理功能稳态，导致猪只发病。已证实外源表达MGF110-5L-6L蛋白可诱导宿主细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应，并通过活化PERK 和PKR 激酶触发e IF2α 的磷酸化，进而诱发综合应激反应，致使猪机体的细胞蛋白翻译阻滞以及应激颗粒产生。

miR2911 在非洲猪瘟病毒基因中的靶点非常保守，不同时期和不同地区的非洲猪瘟病毒分离毒株的靶点同源性很高。因此，金银花源miR2911 具有潜在抑制当前非洲猪瘟病毒流行毒株复制的作用。下一步，将与其他实验室合作，构建miR2911 过表达质粒，在细胞水平验证miR2911 抑制上述病毒复制的能力；在此基础上，进一步将miR2911 导入酵母菌、马铃薯、番茄、苜蓿等植物中，通过给猪只饲喂上述转基因菌株的植物，提高猪抗病毒的能力。并通过检测猪只排毒情况和病理损伤程度，在动物体内开展miR2911 抗病毒感染作用。

4 结论

本试验通过生物信息学方法预测了miR2911 对非洲猪瘟病毒关键基因的靶向性并对此展开分析。miR2911可较好地靶向非洲猪瘟病毒的NP1450L 基因，显示出miR2911 潜在抑制非洲猪瘟病毒复制的能力。根据遗传进化树结果显示miR2911 在非洲猪瘟病毒基因上的靶向区域100%同源，表明miR2911 具有靶向不同流行非洲猪瘟病毒毒株的能力。综上所述，本文发现miR2911 对于非洲猪瘟病毒具有潜在抑制作用，为进一步探索其抑制原理及相关药物的研发提供理论依据。