分子蒸馏技术分步法制备酶促酯交换反应的高含量ω-3 PUFA鱼油甘油酯

沈琳洁，林荣发，张连岳，冯传志，傅 红

（福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

海洋浮游植物和藻类含有的ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）经食物链参与海洋鱼类脂质代谢[1]，其中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在预防和治疗心血管疾病、癌症、糖尿病、炎症等方面发挥重要作用[2-6]。天然深海鱼油中EPA和DHA以构成甘油三酯（triacylglycerol，TG）的脂肪酸形式存在，其总含量一般不超过30%；利用化学醇解及浓缩技术制备的乙酯型鱼油可以将ω-3 PUFA含量提高到50%以上[7]。但是近年研究发现，乙酯中的ω-3 PUFA不仅比TG需要额外的羧基脂肪酶水解，而且对胰脂肪酶水解抵抗能力比TG高50 倍，这显著降低了乙酯中ω-3 PUFA的消化吸收效率[8-10]；另外乙酯在体内分解产生的乙醇容易引发乙醇不耐症人群和婴幼儿的不良反应[11]。因此，制备食用安全性好和生物利用率高的高ω-3 PUFA含量甘油酯型鱼油产品，成为特医食品等领域的新经济增长点，目前挪威、丹麦、韩国等在此领域已具备较成熟的商业化技术，我国正处于研发和试生产阶段[12]。

利用脂肪酶油脂改性技术，以天然鱼油和乙酯型鱼油为底物制备高ω-3 PUFA含量的鱼油甘油酯产品是目前鱼油高附加值产业发展方向[13-14]。现有文献主要集中于脂肪酶类型选择和反应条件参数优化，对酯交换产物的分离及其副产物再利用的研究较少。乙酯型鱼油原料价格贵，利用传统的减压分离技术难以完全分离成分复杂的酯交换产物鱼油甘油酯，成为限制工业化生产的重要因素。分子蒸馏技术加热温度低、受热时间短，可以根据脂肪酸碳链长度和饱和程度对油脂热敏性成分进行高效的多组分分离。在酯交换混合产物分离方面，He Jianlin等[15]报道了酶促乙醇反应结合分子蒸馏技术提高藻油DHA含量的方法，蒸馏温度150 ℃和真空度≤1×10-3MPa分离得到富含DHA甘油酯的重组分和含有棕榈酸、DHA乙酯的轻组分；Wang Xiumei等[16]用酶催化乙酯与甘油反应生成含有76.46% TG的产物，分子蒸馏温度175 ℃、真空度3 Pa时分离产物中的甘油二酯和乙酯，最终将TG含量提高至96.2%；Ştefan等[17]分离山茶油中的游离脂肪酸时，分子蒸馏的脱酸效率可达92%。另外，在PUFA富集方面，傅红等[18]通过二级分子蒸馏，获得了63%ω-3 PUFA含量的乙酯型鱼油；余瑶盼等[19]在真空压力1 Pa、一级蒸馏温度120 ℃和二级蒸馏温度160 ℃时，将石榴籽油共轭亚麻酸乙酯含量从80.68%提升至95.23%。

本研究在脂肪酶促酯交换技术制备高ω-3 PUFA含量的鱼油甘油酯产品研究基础上[13,20-23]，采用分子蒸馏法分步应用于鱼油酯交换反应产物的分离。通过一级分子蒸馏技术分离鱼油酯交换产物中的一级重相产物甘油酯（包括TG、甘油二酯和甘油单酯）和一级轻相副产物，并采用高温气相色谱及核磁共振氢谱等技术验证产物的分离效果；将一级轻相副产物直接参与下一级的酶促酯交换反应中，或再通过分子蒸馏技术富集轻相乙酯副产物中的ω-3 PUFA，参与下一级的酶促酯交换反应，以此制备不同ω-3 PUFA含量等级的甘油酯型鱼油产品，实现原料和副产物的最大化利用，降低原料成本。分子蒸馏技术在酶促酯交换产物分离工艺中的高效使用，可以为实现绿色、能源节约型高含量ω-3 PUFA的鱼油甘油酯产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料TG型鱼油（ω-3 PUFA含量≤30%）、原料乙酯型鱼油（ω-3 PUFA含量≥75%）福建天马科技集团有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 丹麦诺维信公司；正己烷等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FMD-150分子蒸馏仪 杜马司科学仪器（江苏）有限公司；AVANCE NEO 600核磁共振波谱仪 德国Bruker公司；GC7890A气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；CH1020B超级恒温水浴槽 沙鹰科学仪器（上海）有限公司；HJ-4A磁力搅拌器 北京浩开科技有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯交换产物制备

以质量比1∶1将TG型鱼油和乙酯型鱼油作为反应底物置于夹套烧杯中，加入3%（以原料总质量计）的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM，密封烧杯口后于52 ℃恒温磁力搅拌器避光反应24 h[20]。酯交换反应结束后，80 ℃保持20 min使酶灭活，8000 r/min离心10 min去除脂肪酶固体，得到一级酯交换反应产物鱼油混合酯。

1.3.2 分子蒸馏分步制备工艺

在体系压强5 Pa、蒸馏温度140 ℃、刮板转速240 r/min和进料速率0.2 mL/min的一级分子蒸馏优化条件下，分离一级酯交换产物获得分离产物一级重相和一级轻相。其中一级轻相既可直接参与二级酯交换反应和分子蒸馏分离（反应条件和一级相同），也可将一级轻相再经分子蒸馏富集其中的ω-3 PUFA后，再参与二级酯交换反应和分子蒸馏分离。上述工艺得到不同等级的鱼油甘油酯产品，工艺流程图如图1所示。

图1 不同ω-3脂肪酸含量等级的甘油酯型鱼油产品的分步制备Fig.1 Flow chart for the preparation of triglyceride-type fish oil products with different ω-3 fatty acid contents

1.3.21 酯交换混合产物中甘油酯的分离

称取一定量酯交换产物鱼油加入分子蒸馏加料罐，探究分子蒸馏体系压强、蒸馏温度、刮板转速和进料速率对重相中的甘油酯型鱼油ω-3 PUFA（EPA＋DHA）含量的影响。将薄层制备色谱法得到的酯交换反应产物中甘油酯混合谱带（包括TG、甘油二酯和甘油单酯三条谱带）ω-3 PUFA含量作为标准值，按下式计算分子蒸馏重相中的ω-3 PUFA含量和前者的相对偏差，相对偏差越小，说明分离效果越好，其中ω-3 PUFA含量由气相色谱法测定。

式中：X1为分子蒸馏重组分中ω-3 PUFA含量；X2为薄层制备色谱甘油酯中ω-3 PUFA含量。

1.3.22 分子蒸馏富集一级轻相的ω-3 PUFA

称取一定量一级轻相加入分子蒸馏加料罐，在体系压强5 Pa时探究刮板转速、冷凝温度和蒸馏温度对一级轻相中的ω-3 PUFA富集效果的影响。收集ω-3 PUFA富集相，经气相色谱检测其EPA＋DHA含量，并按下式计算乙酯型鱼油富集相得率。

式中：m富为富集相乙酯型鱼油的质量/g；m进为进料乙酯型鱼油的质量/g。

1.3.3 薄层色谱法分析产物及制备甘油酯

称取一定量样品溶解于50 μL正己烷，用定量点样毛细管吸取1 μL在距薄层板底边2 cm处点上直径＜4 mm的圆点，放入展开缸中（展开剂为正己烷∶乙醚∶甲酸=80∶20∶2，V/V）。利用上行法展开，待展开剂上升至距薄层板顶端2 cm处时取出晾干，喷洒茴香醛显色剂，在110 ℃加热条件下根据Rf值判断各脂质组分[24]。

将30 mg未经分子蒸馏分离的酶促酯交换反应混合产物溶解于50 μL正己烷，均匀点样于20 cm×20 cm薄层板上并连成1 条直线，用展开剂（正己烷∶乙醚∶乙酸=80∶20∶1，V/V）进行层析，展开结束晾干后喷洒2’,7’-二氯荧光素显色剂，在紫外灯下观察并刮下甘油酯混合谱带（包括TG、甘油二酯和甘油单酯3 条谱带）对应区域[25-26]。按上述方法收集制备的3～5 份混合谱带样品，气相色谱分析脂肪酸含量。

1.3.4 分离产物的甘油酯成分和脂肪酸组成分析

1.3.41 高温气相色谱法测定分子蒸馏分离产物组成

取样品溶解于正己烷溶剂中，通过高温气相色谱法分析重组分组成。色谱条件：Agilent 7890A气相色谱仪；Agilent VF-5ht高温柱子；检测器为氢火焰离子化检测器；进样口温度325 ℃，检测器温度340 ℃，色谱柱升温程序：以5 ℃/min从50 ℃升到400 ℃。进样量2 μL，分流比为100∶1[27]。

1.3.42 气相色谱法测定脂肪酸组成

样品采用甲酯化处理，经气相色谱法测定脂肪酸组成。色谱条件：Agilent 7890A气相色谱仪；Agilent J&W DB-FATWAX超高惰性柱；氢火焰离子化检测器；进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃；色谱柱升温程序：40 ℃保持2 min，以55 ℃/min升至171 ℃，保持25 min，再以10 ℃/min升至215 ℃，保持25 min，直至分析完成；载气为纯氮气，流速30 cm/s，横流模式，氢气流速40 mL/min；空气流速400 mL/min，尾吹气为氮气，流速为25 mL/min，进样量1 μL，分流比为20∶1[28]。

1.3.5 核磁共振氢谱法分析甘油酯分离效果

分别称取50 mg样品溶于500 μL氘代氯仿后装入5 mm核磁管，置于600 MHz运行的核磁共振波谱仪测试，获得核磁共振氢谱。参数条件：以四甲基硅烷为内标物，扫描次数32 次，脉冲宽度90°，采集时间2.7525 s，谱宽12×10-6，脉冲间隔1 s，脉冲序列zg30[29]。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 2021软件绘图，并使用MestReNova软件分析核磁共振氢谱图。数据为3 次实验测定的平均值，以±s表示。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱法分析产物成分

在前期工艺参数优化酶促原料TG型鱼油和原料乙酯型鱼油的酯交换反应基础上[13,20-21]，采用分子蒸馏技术分离酯交换产物的甘油酯，分离产物为分子蒸馏重相和分子蒸馏轻相两部分。图2是反应底物、酯交换反应后的混合产物及其一级分子蒸馏效果较完全的分离产物（一级重相、一级轻相）薄层色谱图，其中重相在胆固醇酯、TG、甘油二酯和甘油单酯所对应的谱带上有清晰的斑点，轻相则含有乙酯型鱼油和游离脂肪酸的斑点。因此由薄层色谱图初步判断，分子蒸馏法可以将乙酯型鱼油等副产物从甘油酯中分离。

图2 酯交换底物及一级分子蒸馏分离产物的薄层色谱图Fig.2 Thin layer chromatograms of transesterification substrates and primary molecular distillation products

2.2 分子蒸馏分离酯交换产物的工艺条件

一级分子蒸馏的各工艺因素优化效果见图3。由图3a可知，在本分子蒸馏设备能够达到的最小体系压强5 Pa时，重相ω-3 PUFA含量相对偏差最小达到6.02%。图3b显示，在110～150 ℃时，随着分子蒸馏温度的升高，重相ω-3 PUFA分离的相对偏差降低，当蒸馏温度为140 ℃时达到1.19%，继续提高蒸馏温度相对偏差无明显降低；这是因为蒸馏温度的升高有助于高真空条件下各组分根据平均自由程的差别而实现完全分离，游离脂肪酸和乙酯型鱼油充分逸出到轻组分，甘油酯型鱼油则被留在重相。图3c表明，刮板转速为180～260 r/min时相对偏差先下降后升高，当刮板转速达到240 r/min时相对偏差达到最小；提高刮板转速使物料在蒸发面上形成的液膜厚度降低，导致传热和传质过程更加完全；但继续增加转速使蒸发面上的料液流速加快，轻相不能完全逸出。图3d显示，进料速率越慢相对偏差越小，因为料液在蒸发面上滞留时间延长有助于达到充分的传热传质，使分子平均自由程小的游离脂肪酸和乙酯型鱼油有足够的时间逸出，和重相分离。在分子蒸馏分离酯交换产物的体系压强5 Pa、蒸馏温度140 ℃、刮板转速240 r/min和进料速率0.2 mL/min优化条件下，重相甘油酯和轻相乙酯型鱼油的分离效果分别对应于图2第4、5条薄层色谱谱带。

图3 分子蒸馏压强（a）、蒸馏温度（b）、刮板转速（c）、进料速率（d）对重相ω-3 PUFA分离相对标准偏差的影响Fig.3 Effects of molecular distillation pressure (a),distillation temperature (b),scraper speed (c),and feeding rate (d) on the relative standard deviation of ω-3 PUFA separation from heavy phase

2.3 分子蒸馏技术富集一级轻相乙酯型鱼油的ω-3 PUFA含量

一级分子蒸馏得到的轻相乙酯型鱼油副产物，可以进一步通过分子蒸馏富集其ω-3 PUFA含量再进行二级酶促酯交换反应。由图4a可知，提高刮板转速乙酯型鱼油富集相ω-3 PUFA含量先升高后下降，得率呈缓慢上升趋势。这是因为刮板转速太慢导致蒸发壁面形成液膜厚度大，不利于传质传热；刮板转速过快液膜内流体的径向速度显著增大，导致飞溅现象[30-31]；当刮板转速至240 r/min时有利于形成均匀的液膜状态，达到理想的分离效果。由图4b可知，随着冷凝温度升高，分离产物富集相的ω-3 PUFA含量略呈下降趋势，得率略呈上升趋势，冷凝温度为20 ℃能够达到较好的分离效果。图4c显示，分子蒸馏压力为5 Pa时，蒸馏温度的升高使产物富集相ω-3 PUFA含量上升、得率下降；当蒸馏温度为110 ℃时，ω-3 PUFA含量由蒸馏前的60.73%提高到78.01%，富集相得率为32.97%。

图4 刮板转速（a）、冷凝温度（b）、蒸馏温度（c）对一级轻相中ω-3 PUFA含量富集效果的影响Fig.4 Effects of scraper speed (a),condensation temperature (b) and distillation temperature (c) on the enrichment of ω-3 PUFA in the first-stage light phase

2.4 分子蒸馏分离产物的组成和脂肪酸含量

2.4.1 分子蒸馏产物组成分析

一级分子蒸馏的轻相副产物通过分子蒸馏富集其ω-3 PUFA，进行二级酶促酯交换反应和二级分子蒸馏产物分离，根据游离脂肪酸、乙酯型鱼油和不同酰基甘油酯的等价碳数不同，利用高温气相色谱分析各组分[32]。乙酯型鱼油富集相参与的两级分子蒸馏产物组成及含量见表1，其中酯交换反应混合产物、油酸乙酯标准样品、一级分子蒸馏产物重相的高温气相色谱图见图5。表1结果表明，经一级分子蒸馏后，酯交换鱼油产物中的游离脂肪酸、乙酯和微量甘油单酯进入轻相，而甘油二酯、TG和大多数甘油单酯则进入重相；一级重相中的游离脂肪酸含量为0.54%，甘油单酯、甘油二酯和TG的含量分别达到14.23%、24.01%和61.22%；一级重相得率为47.13%，一级轻相得率48.36%，总损耗率4.51%。一级轻相经分子蒸馏富集ω-3 PUFA后的富集产物中含有98.86%乙酯，若乙酯型鱼油富集相继续参与二级酶促酯交换反应和二级分子蒸馏，获得的二级产物重相中的甘油单酯、甘油二酯和TG的含量分别达到16.28%、19.31%、63.95%，二级重相和轻相得率分别为46.23%和47.81%，总损耗率5.96%。

表1 一级轻相富集ω-3 PUFA后的两级分子蒸馏产物组成及含量Table 1 Changes in composition of the first-stage heavy and light phase after sequential ω-3 PUFA enrichment and secondary molecular distillation %

图5 高温气相色谱法分析酯交换反应混合产物（a）、油酸乙酯标样（b）和一级分子蒸馏产物重相（c）Fig.5 HTGC chromatograms of transesterification products (a),ethyl oleate standard (b),and heavy phase of primary molecular distillation products (c)

2.4.2 脂肪酸组成分析

气相色谱法分析酯交换原料和分子蒸馏分步制备产物的各脂肪酸组成和含量，结果见表2。原料TG型鱼油和原料乙酯型鱼油的ω-3 PUFA含量分别为29.65%和83.75%，经酶促酯交换反应和一级分子蒸馏后，一级重相的ω-3PUFA含量达到53.76%，一级轻相的ω-3 PUFA含量达到60.73%。当进一步采用分子蒸馏富集一级轻相的ω-3 PUFA含量后，富集相的ω-3 PUFA含量提高到78.01%；将其与原料TG型鱼油进行二级酶促酯交换反应及二级分子蒸馏分离后，得到的二级重相1的ω-3 PUFA含量达到51.38%。若一级轻相不经分子蒸馏富集，直接作为二级酯交换底物与原料TG型鱼油进行酯交换反应，则二级重相2的ω-3 PUFA含量仅达到42.37%。上述两级酯交换鱼油甘油酯产品的脂肪酸含量均符合CXS 329-2017《国际食品法典标准 鱼油》对浓缩甘油酯型鱼油（EPA＋DHA=35%～50%）的定义[33]，因此采用分子蒸馏分步制备酯交换产物技术，可以实现鱼油甘油酯ω-3 PUFA含量的分级，增加产品的多元化。

表2 两级酶促酯交换反应及分离产物的脂肪酸组成及含量Table 2 Fatty acid composition and content of two-stage enzymatic transesterification products and molecular distillation products %

2.5 分子蒸馏产物中重组分鱼油甘油酯结构分析

利用核磁共振氢谱法分析分子蒸馏分离酯交换产物一级重相的脂质组分。氢原子受不同脂肪酸组成和脂质类型中化学环境的影响，表现为核磁共振氢谱中化学位移的信息不同[34]。原料TG型鱼油、原料乙酯型鱼油、未分离的酯交换反应混合产物和一级分子蒸馏重相4 种样品核磁共振氢谱依次如图6所示。

图6 酯交换反应及分子蒸馏分离产物的核磁共振氢谱全谱图及δ 1.2～1.3局部放大谱图Fig.6 1H-NMR spectra with zoom-in at δ 1.2-1.3 of different fish oil samples

对比图6a、b，酯交换原料TG型鱼油和乙酯型鱼油的核磁共振氢谱存在δ1.2～1.3和δ4.15～4.35的两处差异，其中原料TG型鱼油和分子蒸馏分离的一级重相鱼油只有δ1.267处明显的单峰，原料乙酯型鱼油有δ1.248和δ1.251两个化学位移信号峰；从信号峰强度看出，原料乙酯型鱼油的DHA含量为72.97%，明显高于EPA含量8.84%，图中δ1.251对应的DHA乙酯的—CH3基团振动的信号峰强度更高，这和理论上推测出DHA中最近的C＝C（C4位置）更接近其乙基的—CH3部分，所以与δ1.248 和δ1.251的—CH3基团共振分别归属于EPA和DHA乙酯的结论一致[35]；相比之下，原料TG型鱼油和一级分子蒸馏分离的重相鱼油并未显示出上述基团振动峰。另外，根据鱼油产品核磁共振氢谱各信号峰的归属可知[36]，甘油酯型鱼油在δ4.15～4.35的双二重峰（峰L）来源于TG主链上sn-1,3位的—CH2OCOR基团共振，乙酯型鱼油在δ4.12处显示明显的多重峰（峰K）来源于乙酯末端—CH2OCR。酯交换混合产物核磁共振氢谱呈现出兼具甘油酯型鱼油和乙酯型鱼油的谱图特征，但经分子蒸馏分离的重相鱼油核磁指纹图谱与原料TG型鱼油的特征基本一致，两者在δ4.15～4.35处峰高的差异可归因为酯交换后TG骨架sn-1,3位置氢原子分布的复杂化。因此，核磁共振氢谱分析结果进一步说明了分子蒸馏分离的重相鱼油属于甘油酯型产品，不含乙酯型鱼油。

3 结论

采用分子蒸馏方法，对脂肪酶促油脂改性技术制备食用安全性好和生物利用率高的高含量ω-3 PUFA鱼油甘油酯产物进行有效分离和乙酯型鱼油再利用。酶促酯交换产物在分子蒸馏压强5 Pa、蒸馏温度140 ℃、刮板转速240 r/min和进料速率0.2 mL/min时，重相ω-3PUFA含量和薄层层析分离制备ω-3 PUFA含量的相对偏差最小，不含乙酯型鱼油副产物，一级重相ω-3 PUFA含量由原料TG型鱼油的29.65%提高到53.76%；再通过分子蒸馏进一步富集乙酯型鱼油副产物中的ω-3 PUFA，蒸馏压强5 Pa、蒸馏温度110 ℃、刮板转速240 r/min和冷凝温度20 ℃时，一级轻相中ω-3 PUFA含量由60.73%提高到78.01%，富集相得率为32.97%，其参与二级酶促酯交换反应和分离获得二级重相1ω-3 PUFA含量达到51.38%。若一级轻相直接参与二级酯交换反应和分离，其二级重相2ω-3 PUFA含量仅为42.37%。采用分子蒸馏分步制备技术可以获得不同ω-3 PUFA含量等级的甘油酯型鱼油产品，同时实现原料和副产物的最大化利用。