不同胶原肽对光损伤皮肤细胞的修复作用

刘爽，刘爱青,2，王佳，闫征

1.北京盛美诺生物技术有限公司（北京 100062）；2.安徽盛美诺生物技术有限公司（淮北 235000）

胶原蛋白是动物结缔组织的重要组成成分，占动物总蛋白含量的25%～30%，据不完全统计，人体内含有20余种胶原蛋白[1]。胶原蛋白肽作为一种功能性食品原料，在全球范围内得到广泛应用[2]，其是以动物的皮、骨为原料通过酶解技术制备的小分子物质。随着人们对胶原蛋白肽市场的认知深度增加，特殊的肽段也越来越受市场关注，尤其是胶原三肽。胶原三肽是由大分子胶原经过酶解得到的由3个氨基酸组成的小肽。胶原三肽的氨基酸组成为Gly-X-Y，其中X的位置通常是脯氨酸（Pro），Y通常为羟脯氨酸（Hyp）和羟赖氨酸（Hyl），后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见[3]。理论上胶原蛋白含有至少400个三肽序列，含量超过1%的仅24种，其中Gly-Pro-Hyp含量最为丰富[3]。

在功效方面，胶原三肽对皮肤的生长、修复具有重要的促进作用[4-6]，以及具有抗氧化作用[7]等。Choi等[8-9]报道胶原三肽可提高人体皮肤的弹性和含水量；成静等[10]报道胶原三肽可抑制黑色素的形成；Hee-Bong等[11]报道胶原三肽可抑制光老化引起的皱纹的形成，证明胶原三肽具有作为抗光老化剂的潜力。光损伤也是较受关注的皮肤问题，其表现为皮肤暴露部位粗糙、皱纹加深加粗、不规则性色素沉着、真皮弹性纤维变性及降解产物蓄积等，紫外线的照射会使皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成减少，导致细胞的氧化损伤[12]。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞，不仅能促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性蛋白以及多种细胞修复因子，从而修复老化皮肤[13-14]。关于胶原蛋白肽对皮肤光老化的修复报道较多[15-16]，但胶原三肽在该方面的研究较少，试验主要研究胶原三肽对光损伤皮肤细胞的修复作用，并对比普通胶原蛋白肽对皮肤成纤维细胞的修复差异，以及不同工艺产品的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要试剂及耗材

DMEM培养基（赛默飞世尔科技）；DMEM/F-12培养架（赛默飞世尔科技）；0.25%胰酶（赛默飞世尔科技）；青链霉素混合液（赛默飞世尔科技）；磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔科技）；胎牛血清（赛默飞世尔科技）；蛋白酶抑制剂（上海罗氏制药有限公司）；细胞培养板（康宁公司）；细胞培养皿（康宁公司）；Anti-MMP1抗体[EP1247Y]，艾博抗（上海）贸易有限公司；Anti-MMP13抗体[EP1263Y]，艾博抗（上海）贸易有限公司；Anti-Collagen I抗体[EPR7785]，艾博抗（上海）贸易有限公司；Anti-COL3A1（E8D7R），Cell Signaling Technology；Anti-Elastin抗体[EPR20603]，艾博抗（上海）贸易有限公司；Anti-GAPDH抗体[EPR16891]，艾博抗（上海）贸易有限公司；Goat anti Mouse antibody（北京康为生物科技有限公司）；Goat anti Rabbit antibody（北京康为生物科技有限公司）；NC膜（0.45 μm孔径Millipore，默克生物）；ECL Millipore（默克生物）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；牛血清白蛋白Amresco（北京伊诺凯科技有限公司）；丙烯酰胺Amresco（北京伊诺凯科技有限公司）；N, N'-亚甲基双丙烯酰胺Amresco（北京伊诺凯科技有限公司）；过硫酸铵Amresco（北京伊诺凯科技有限公司）；吐温-20 Amresco（北京伊诺凯科技有限公司）；N, N,N´, N´-四甲基乙二胺（赛默飞世尔科技）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物）；羟脯氨酸检测试剂盒，艾博抗（上海）贸易有限公司；透明质酸检测试剂盒（R & D Systems）；细胞凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）。

1.1.2 主要试验与仪器

低温冷冻离心机（赛默飞世尔科技）；电泳槽，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；电泳仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；酶标仪（赛默飞世尔科技）；湿转电泳槽，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；水平脱色摇床（北京大龙兴创实验仪器有限公司）；细胞培养箱（赛默飞世尔科技）；UV辐照系统（法国VILBER LOURMAT公司）；倒置显微镜（徕卡显微系统）；流式细胞仪CytoFlex（贝克曼库尔特生命科学事业部）。

1.2 细胞生物学相关试验方法及步骤

1.2.1 人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblast，HSF）常规培养

将HSF细胞在10 cm皿中培养，待细胞密度至80%融合度时吸弃上清液，加入2 mL 0.25%胰酶消化细胞；消化完成后加入等体积完全培养基（10% FBS的DMEM+双抗）中和胰酶，将细胞转移至15 mL离心管中，按1 500 r/min室温离心5 min；弃上清液后加入2 mL新鲜完全培养基重悬细胞，吸取200 μL加入新10 cm培养皿中；加入10 mL新鲜完全培养基，将细胞于37 ℃，5% CO2培养箱内继续培养。待细胞密度至80%时再次进行传代或铺板。

1.2.2 多肽处理建模

将1#胶原三肽（市购，平均分子量约800 Da）、2#胶原三肽（市购，平均分子量约500 Da）、1#胶原蛋白肽（市购，平均分子量约2 000 Da）、2#胶原蛋白肽（市购，平均分子量约2 000 Da）分别稀释至10，50，100，500和1 000 mg/L不同的质量浓度；将处于对数生长期的HSF细胞使用0.25%胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80%～90%；将肽按照5个不同浓度加入细胞上清液，轻轻混匀后继续培养；在加入肽处理后第1～第5天分别收集细胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；测定450 nm波长处吸光度，并根据吸光度计算细胞增殖曲线。

1.2.3 UVB处理建模

将处于对数生长期的HSF细胞使用胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80%～90%；在100和200 mJ/cm2的UVB照射下处理细胞；在UVB后第1～第5天分别收集细胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；测定450 nm波长处吸光度，并根据吸光度计算细胞增殖曲线。

1.2.4 CCK8评估UBV处理条件下不同多肽就细胞增殖的影响

将处于对数生长期的HSF细胞使用胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80%～90%；将4种肽按照50，100和500 mg/L加入细胞上清液，轻轻混匀后继续培养6 h。

在200 mJ/cm2的UVB照射下处理细胞；在加入多肽处理后第1～第5天分别收集细胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；测定450 nm波长处吸光度，并根据吸光度计算细胞增殖曲线。

1.2.5 细胞凋亡检测

将处于对数生长期的HSF细胞使用胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80%～90%；将4种肽按照50，100和500 mg/L加入细胞上清液，轻轻混匀后继续培养6 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下处理细胞；处理完成后继续培养24 h，用胰酶消化细胞，按1 500 r/min室温离心5 min，收集细胞；使用预冷PBS重悬细胞2次，按1 500 r/min离心5 min洗涤细胞；每管加入300 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞；每管加入5 μL Annexin V-FITC，混匀细胞，室温避光染色20 min；每管加入5 μL PI，室温避光染色5 min；每管补加200 μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀后流式细胞仪进行检测。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）

将处于对数生长期的HSF细胞使用胰酶消化后铺至12孔板中，过夜培养至细胞汇合率为80%～90%；将4种肽按照50，100和500 mg/L加入细胞上清液，轻轻混匀后继续培养18 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下处理细胞；处理完成后继续培养24 h，收集不同处理组细胞上清液培养基；将上清液在4 ℃条件下按1 500 r/min离心10 min，将上清液转移至新的离心管中；使用ELISA试剂盒检测透明质酸和羟脯氨酸含量。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3 Western Blotting检测HSF细胞中蛋白表达

1.3.1 蛋白提取

将不同处理组和对照HSF细胞使用胰酶消化后收集。弃上清液后在细胞沉淀中加入500 μL细胞裂解液，反复吹悬细胞沉淀后冰上放置30 min，按12 000 r/min离心15 min。离心完成后取上清液作为待测样品。

1.3.2 BCA蛋白定量和样品制备

将待测样本溶于稀释缓冲溶液中，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量。定量完成后使用蛋白裂解液调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液，将样品终质量浓度定为1 mg/mL。将加入缓冲液的样品煮沸10 min进行蛋白变性，煮沸后的样品在4 ℃以10 000 r/min离心30 s后备用。

1.3.3 蛋白表达量检测

根据目的蛋白分子量，配制10%或12%分离胶及5%浓缩胶；将待检测蛋白样品加入上样孔，每孔上样量约20 μg；上样完成后进行电泳，浓缩胶恒压90 V电泳约20 min。分离胶恒压160 V电泳约90 min，通过预染蛋白Marker和Loading buffer上样缓冲液停止电泳；电泳完成后进行转模，在300 mA恒流冰浴转膜1 h；转膜完成后5% BSA室温轻摇45 min进行封闭减少非特异杂交；使用1% BSA-TBST稀释一抗，具体一抗稀释度见抗体说明书进行优化。加入一抗后在4℃孵育过夜；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；使用1% BSA-TBST稀释二抗，二抗稀释度1∶10 000，加入二抗后室温轻摇60 min；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；二抗孵育完成后将ECL发光液加到膜上，室温反应3 min。使用胶片曝光10 s～3 min，显影2 min后进行定影。

2 结果及分析

2.1 CCK-8评估胶原肽对UVB处理条件细胞增殖和活力的影响

从图1可以看出，与UVB处理组相比，胶原三肽组、胶原蛋白肽组均可促进光辐照后的细胞增殖，且呈一定剂量相关性，其中2#胶原三肽的效果最好，之后依次为1#胶原三肽、2#胶原蛋白肽、1#胶原蛋白肽。2#胶原三肽试验第5天细胞水平可与达到未处理组一致，与UVB组差异极显著（P＜0.001）。

图1 胶原肽对UVB处理后细胞增殖和活力的影响

2.2 流式细胞术评估胶原肽对UVB处理条件下细胞凋亡比例

从图2可以看出，UVB处理后细胞凋亡数量显著增加。胶原三肽组、胶原蛋白肽组均减低细胞凋亡数量，且呈一定剂量相关性，其中2#胶原三肽的效果最好，之后依次为1#胶原三肽、2#胶原蛋白肽、1#胶原蛋白肽。

图2 流式细胞术评估胶原肽对UVB处理条件下细胞凋亡比例

2.3 胶原肽对UVB处理条件下透明质酸含量的影响

从图3可以看出，胶原三肽组、胶原蛋白肽组均可促进光辐照损伤成纤维细胞生成透明质酸，且呈一定剂量相关性，其中2#胶原三肽的效果最好，与UVB处理组相比差异显著（P＜0.01）。

2.4 胶原肽对UVB处理条件下羟脯氨酸含量的影响

从图4可以看出，胶原三肽组、胶原蛋白肽组均可促进光辐照损伤成纤维细胞生成羟脯氨酸，且呈一定的剂量相关性，效果最好的为2#胶原三肽，其次依次为1#胶原三肽、2#胶原蛋白肽、1#胶原蛋白肽。

图4 ELISA评估胶原肽对UVB处理条件下羟脯氨酸含量的影响

图5 Western blot检测胶原三肽对UVB处理条件下蛋白表达的影响

图6 Western blot检测胶原蛋白肽对UVB处理条件下蛋白表达的影响

2.5 Western blot检测胶原肽对UVB处理条件下蛋白表达的影响

Western Blot检测蛋白表达发现胶，原蛋白肽、胶原三肽均有降低MMP-1、MMP-13及提高COL1a1、COL1a2、原弹性蛋白mRNA的趋势。其中，MMP-1和MMP-13是降解动物体内胶原蛋白的酶，降低其活性，即可减少人体胶原蛋白的流失[17]。

3 结论与讨论

试验通过UVB处理建模，对比不同胶原肽对人皮肤成纤维细胞的保护作用。细胞增殖和细胞凋亡结果显示，胶原三肽及胶原蛋白肽对UVB处理后的人皮肤成纤维细胞均具有一定的修复作用，且呈一定剂量相关性，其中效果显著的依次性为2#胶原三肽＞1#胶原三肽＞2#胶原蛋白肽＞1#胶原蛋白肽。ELISA检测透明质酸和羟脯氨酸的含量显示，胶原三肽、胶原蛋白肽均可以修复UVB损伤后人皮肤成纤维细胞生成细胞外基质的能力，且呈一定剂量相关性，其中效果显著的依次性为2#胶原三肽＞1#胶原三肽＞2#胶原蛋白肽＞1#胶原蛋白肽。Western Blot检测蛋白表达发现，胶原三肽、胶原蛋白肽均有降低MMP-1、MMP-13以及提高COL1a1、COL1a2、原弹性蛋白mRNA的趋势。结果说明，胶原肽对光老化人皮肤成纤维细胞具有一定修复作用，其中胶原三肽的效果优于普通的胶原蛋白肽。

从分子量角度看，试验组胶原三肽组的平均分子量均小于胶原蛋白肽组平均分子量，这可能是影响其发挥修复作用的原因之一，张宁等[18]研究不同分子量的胶原蛋白肽在动物体内吸收过程，其证明分子量越小，吸收速率越快。从结构来看，胶原三肽组的三肽含量高于胶原蛋白肽组，三肽透皮吸收性较强，研究表明三肽可促使成纤维细胞的增殖活性，修复受损组织，即可高效率地促进皮肤透明质酸及胶原蛋白的生成，以实现抗皱、保湿、抗老化、修复等功效[19-21]，Kim[22]利用无毛小鼠验证胶原三肽具有抗光老化的作用。

对胶原三肽的功效近两年已有多项研究报道，如：Han等[23]研究了胶原三肽对UVB下光老化损伤的抑制作用；Saito-Takatsuji等[24]研究了胶原三肽对细胞的保护作用；金载桓等[25]将其应用于食品或化妆品中，来改善免疫力和皮肤状态。胶原三肽在功能性食品中领域也有了越来越多的应用案例，其市场售价高于普通胶原蛋白肽，但是关于该成分的机理研究还较少，与普通胶原蛋白肽的功效对比研究也较少，所以为将其更好、更精确地应用到功能性食品中，可以考虑多针对其机理及具体肽段对机体的具体作用进行更深刻的探讨研究，包括皮肤、骨骼、关节等方面的应用研究，为市场新品的开发提供更完善的理论依据。