蓝莓叶中槲皮素的提取及抗氧化作用

张宏强，李春桃*

锦州医科大学（锦州 121001）

槲皮素（Quercetin）属于黄酮醇类化合物，难溶于水，易溶于碱性溶液。槲皮素大量存在于植物的果实、茎、叶中，具有多种生物活性[1]。蓝莓叶在《本草纲目》已有记载：“其味苦平，无毒，益精气，强筋骨，止泻除睡，久服长生不饥，变白却老。”蓝莓叶已列入中国药典，可以作为普通食品的原料[2]。此次试验以蓝莓叶为原料提取槲皮素，采用超声波乙醇提取槲皮素，通过响应面法，探索其最佳提取条件，并对其体外抗氧化活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

蓝莓叶（湖北牧童蓝莓科技有限公司）；槲皮素标准品（北京索莱宝科技有限公司）；无水乙醇、甲醇、磷酸、高硫酸钾（西陇化工股份有限公司）；DM101大孔树脂（北京索莱宝科技有限公司）；DPPH试剂（合肥千盛生物科技有限公司）；氯化铁（天津百伦斯生物技术有限公司）；邻苯三酚（天津市永晟精细化工有限公司）；ABTS溶液（上海尚宝生物科技有限公司）；醋酸铵、硫酸亚铁（天津市致远化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

LC-15C高效液相色谱仪（岛津仪器苏州有限公司）；KH-500V超声波发生器（昆山禾创超声仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；FA2004B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；SHB-B95A循环水式多用真空泵（陕西太康生物科技有限公司）；DHG-9140电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DK-98-11A恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；UV752紫外分光光度计（上海精科实业有限公司）；XD-52AA数显型旋转蒸发器（上海贤德实验仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 超声辅助提取蓝莓叶槲皮素工艺

将蓝莓叶用高速粉碎机粉碎，过0.125 mm（120目）筛[3]。称取3.0 g蓝莓叶粉末于锥形瓶中，将锥形瓶放置于超声波发生器中，加入一定量体积分数为75%的乙醇，超声提取时间30 min后，真空抽滤[4]。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 料液比对蓝莓叶槲皮素提取的影响

称取3.0 g经干燥、粉碎后的蓝莓叶放入锥形瓶中，在超声波温度50 ℃、超声功率500 W下提取，以蓝莓叶槲皮素提取量为指标，对料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）进行单因素分析[5]。

1.3.2.2 超声温度对蓝莓叶槲皮素提取的影响

称取3.0 g经干燥、粉碎后的蓝莓叶放入锥形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超声功率500 W下提取，以蓝莓叶槲皮素提取量为指标，对超声温度40，50，60，70和80 ℃进行单因素分析[6]。

1.3.2.3 超声功率对蓝莓叶槲皮素提取的影响

称取3.0 g经干燥、粉碎后的蓝莓叶放入锥形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超声温度50 ℃下提取，以蓝莓叶槲皮素提取量为指标，对超声功率300，400，500，600和700 W进行单因素分析[7]。

1.3.3 响应面优化试验

采用 Box-Behnken组合设计，对蓝莓叶槲皮素提取条件进行优化，见表1。

表1 响应面试验因素及水平

1.3.4 蓝莓叶槲皮素含量测定

1.3.4.1 色谱条件的选择

采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：45%甲醇；流动相B：55%磷酸水溶液（1%）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：320 nm[8]。

1.3.4.2 对照品溶液制备

精密称取0.63 mg槲皮素对照品，置于50 mL棕色容量瓶内，加适量50%甲醇，充分摇匀使其溶解，并用甲醇定容至刻度，将其作为对照品储备液。准确量取1 mL对照品储备溶液，定容至20 mL容量瓶，制得6.3 μg/mL槲皮素对照品溶液[9]。

1.3.4.3 供试品溶液制备

取0.85 g槲皮素粉末，加50 mL甲醇，放入超声波发生器中充分搅拌30 min，充分溶解后，用超纯水稀释到一定比例。取上清液以0.45 μm滤膜过滤，取滤液为供试品溶液[10]。

1.3.4.4 线性关系

精密吸取5份对照品溶液，每份吸取2 mL放入安培瓶中，按照上述色谱条件测定槲皮素的含量[11]。以色谱峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，绘制标准回归曲线。计算得回归方程Y槲皮素=318.28X+286.87，相关系数R=0.998 7，确定系数R2=0.999 3。结果表明，槲皮素溶液在0.717～49.690 μg/mL之间存在良好的线性关系。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

避光条件下，取2 mL蓝莓叶槲皮素溶液，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混匀后，静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度，以VC、芦丁为阳性对照，做3次平行试验[12-13]。按式（1）计算蓝莓叶槲皮素DPPH·的清除率。

式中：A0为未加样品的吸光度；Ai为加样品后的吸光度；Aj为样品本身的吸光度。

1.3.6 超氧阴离子自由基清除率能力

取5 mL pH 8.0浓度0.1 mmol/L碳酸钠于试管中，加入1.0 mL蓝莓叶槲皮素溶液和0.4 mL浓度30 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后反应6 min，在328 nm波长处测吸光度。以VC、芦丁为阳性对照，做3次平行试验[14-15]。按式（2）计算超氧阴离子自由基清除率。

式中：A0为未加样品的吸光度；Ai为加样品后的吸光度；Aj为样品本身的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比的影响结果

根据图1显示，提取量开始随着料液比的变化，曲线呈现出逐渐上升的趋势，在比例达到1∶15（g/mL）时图像出现最高峰。随着乙醇添加比例的继续增大，溶液已饱和，提取量逐渐下降。料液比为1∶15（g/mL），提取量最高。

图1 料液比的影响结果

2.1.2 超声温度的影响结果

由图2可知，随着超声温度的不断升高，蓝莓叶槲皮素提取量不断增大。当提取温度达到50 ℃时，蓝莓叶槲皮素提取量达到最大；若继续升高温度，曲线呈现下降状态，这可能是因为槲皮素随着温度的升高表现出不稳定状态，因其分子结构被破坏，从而导致提取量的减少。因此确定最佳超声温度为50 ℃。

图2 超声温度的影响结果

2.1.3 超声功率对提取量的影响

由图3所示，曲线的趋势表现为先上升，达到最高点后下降。当超声功率小于500 W时，提取量逐渐增大；最大提取量在超声功率达到500 W时出现；超声功率大于500 W时，提取量随着超声功率的增大开始减小。提取量总体呈现先上升后下降的变化。因此确定最佳超声功率为500 W。

图3 超声功率的影响结果

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 回归方程的建立与分析

根据单因素试验结果，超声波辅助提取蓝莓叶槲皮素以75%乙醇为溶剂，最佳料液比1∶15（g/mL）、超声温度50 ℃和超声功率500 W，采用响应面设计三因素三水平优化蓝莓叶槲皮素提取条件。响应面试验设计及结果见表2，分析试验结果得回归方程：Y=8.44-0.43A+0.38B+0.48C-0.21AB+0.16AC-0.45BC-1.29A2-0.14B2-0.65C2。

由表3槲皮素提取量回归方程方差分析可知：P＜0.000 1，该回归方程模型极显著；失拟性P=0.808 1＞0.05，无显性著，说明模型拟合正确；决定系数R2=0.997 7＞0.9，校正系数=0.994 7＞0.9，说明该模型拟合程度较高，该方程可应用于蓝莓叶槲皮素的超声辅助提取工艺研究。由F值可知，影响槲皮素提取量各因素作用大小比较：超声功率（C）＞料液比（A）＞超声温度（B）。

表3 槲皮素提取量回归方程方差分析

2.2.2 响应面各因素交互作用分析

各因素之间交互作用对槲皮素提取量的影响见图4～图6。等高线图可以直观反映出交互因素对槲皮素提取量的影响程度。交叉线越平稳，形状呈圆形，代表交互作用不显著；而交叉线越陡峭，形状呈椭圆形，则代表交互作用显著。固定超声功率，随着超声温度和料液比的增加，槲皮素提取量呈现先增大后减小的趋势，曲面坡度较陡，等高线呈椭圆形，则超声温度和料液比两因素交互作用显著；固定超声温度，随着超声功率和料液比的增加，槲皮素提取量呈现先增大后减小的趋势，曲面坡度较陡，等高线呈椭圆形，则超声功率与料液比两因素交互作用显著；固定料液比，槲皮素提取量随着超声功率和超声温度的升高而降低，曲面坡度陡峭，两因素作用极显著。

图4 超声温度和料液比对槲皮素提取量影响的响应面图和等高线

图5 超声功率和料液比对槲皮素提取量影响的响应面图和等高线

2.2.3 验证试验结果

经响应面试验优化，最终得出蓝莓叶槲皮素超声辅助提取的最优条件：料液比1∶13.773 g/mL，超声温度51.288 ℃，超声功率499.123 W。在此条件下，槲皮素提取量为8.765 mg/g。考虑到实际操作会存在一定误差，将工艺条件进行优化为料液比1∶15 g/mL、超声温度50 ℃、超声功率500 W。在此条件下，进行3组平行试验，槲皮素提取量为8.396 mg/g。与响应面试验优化得出的最大值之间存在4.2%的误差，说明该模型能较好地预测和分析蓝莓叶槲皮素超声辅助提取的工艺条件。

2.2.4 高效液相色谱法定量结果分析

将经DM101大孔树脂纯化后的蓝莓叶槲皮素，通过高效液相色谱仪测定，测定波长为320 nm。从图7和图8可知，蓝莓叶槲皮素在该分离条件下达到很好的分离效果，槲皮素样品液在14.5 min处有较好的吸收峰，与槲皮素标准品的出峰时间完全一致，可以确定经提取纯化后的样品为槲皮素。

图7 槲皮素对照品HPLC图

图8 槲皮素样品HPLC图

2.3 蓝莓叶槲皮素体外抗氧化试验结果分析

2.3.1 DPPH自由基清除率试验结果

由图9可知，在0.5～2.5 mg/mL范围内，蓝莓叶槲皮素对DPPH自由基清除率逐渐增大。当质量浓度达到2.5 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到43.5%，DPPH自由基清除能力低于VC的DPPH自由基清除能力，而高于芦丁的DPPH自由基清除能力。此后随浓度增加，三者对DPPH自由基清除能力变化不大。

图9 蓝莓叶槲皮素、VC和芦丁对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 超氧阴离子自由基清除率试验结果

由图10可知，在0.5～4.5 mg/mL范围内，蓝莓叶槲皮素、芦丁、VC对超氧阴离子自由基清除率，随着浓度的增大而升高。当质量浓度达到4.5 mg/mL时，三者对超氧阴离子自由基清除率达到最大，分别为45.3%，37.4%和85.8%。当这三者浓度相同时，其对超氧阴离子自由基清除率VC最高、蓝莓叶槲皮素次之、芦丁最低。

图10 蓝莓叶槲皮素、VC和芦丁对超氧阴离子自由基的清除能力

3 结论

通过单因素试验和响应面试验的方法，对超声波辅助提取槲皮素的工艺进行优化。通过单因素试验和响应面试验确定最优提取条件：在75%乙醇条件下，料液比1∶15（g/mL），超声温度50 ℃，超声功率500 W。影响槲皮素提取量的因素顺序依次为超声功率＞料液比＞超声温度。通过3组平行试验，槲皮素提取量为8.396 mg/g。与响应面试验优化得出的最大值之间存在4.2%的误差，说明该模型能较好地预测和分析蓝莓叶槲皮素超声辅助提取的工艺条件。经高效液相色谱法结果分析得蓝莓叶槲皮素提取物中含有槲皮素单体。通过体外抗氧化试验，蓝莓叶槲皮素DPPH自由基清除率为43.5%，对超氧阴离子自由基清除率为45.3%。该研究结果为开发蓝莓叶槲皮素抗氧化功能性食品提供理论依据。