香菇菜中多糖提取工艺优化及抗氧化研究

谢桂勉*，杨培新，黄莹星，陈一村，郑佳琳

1.揭阳职业技术学院生物工程系（揭阳 522000）；2.汕头大学医学院（汕头 515041）；3.广东好菇婆食品有限公司（揭阳 515300）

香菇菜是以香菇柄为原料，经清洗、浸泡、压榨、打丝、高温炒制（约120 ℃）、灌装加工而成的一道风味独特的潮汕佐餐小菜。香菇具有良好的食用价值和保健价值[1-4]，香菇柄作为加工香菇的副产品，其营养成分及生物活性成分不亚于菌盖部分。研究表明香菇柄中含38.70%膳食纤维、24.80%碳水化合物、19.20%蛋白质、0.35%脂肪、4.80%灰分，同时含有维生素B1、B2、C等维生素，苏氨酸、谷氨酸等氨基酸，Fe、Ca、Mg、Zn、Cu、Mn、K等多种微量元素，其中Fe、K、Ca、Zn含量高于菌盖[5-7]。香菇柄还含有多糖、多酚、黄酮类物质和萜类物质[8-9]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变、免疫调节、抑菌等作用[10-11]，对人体健康非常有益，被加工成香菇酱、香菇柄松、香菇菜等制品。相对香菇多糖的提取及生物活性[12-15]研究，香菇柄多糖提取及抗氧化活性[16-18]研究报道较少，而香菇柄加工制品中多糖的提取及加工方式对多糖抗氧化活性和结构的影响未见报道。试验通过样品前处理、单因素试验、响应曲面优化试验、抗氧化活性评价及红外光谱表征研究香菇柄制品中多糖的提取工艺及香菇菜高温炒制加工方式对功能活性的影响，为加工制品中多糖的提取及有效活性评价提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

香菇柄（西峡县大鹏菇业有限公司）；香菇菜（广东好菇婆食品有限公司）；1 000 mg/mL葡萄糖标准溶液（phygene公司）；DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基清除试剂盒（南京建成生物工程研究所）；重蒸酚（上海吉至生化科技有限公司）；维生素C（上海吉至生化科技有限公司）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

LGJ-18真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；KM-500DE超声波清洗仪（昆山美美超声仪器有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津）；Multiskan FC酶标仪（美国赛默飞）；RE-5205旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA2004B电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；IRSpirit红外光谱仪（日本岛津）；H1850高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 试验方法

香菇菜因加工工艺含有较大量植物油，同时经过高温炒制，制品颜色较深，需经过脱色脱油处理。称取适量香菇菜，加入适量乙醇与蒸馏水（9∶1，V/V）溶液，加热回流脱色脱油，干燥备用（细丝索状）。食用菌多糖已报道的提取方法包括酶提取法、超声波提取法、微波提取法、亚临界水萃取法、酶-微波-超声提取法等[19-24]。试验采用超声波提取法，取适量干燥香菇菜，按超声波时间45 min、液料比40∶1 mL/g、超声波功率300 W、超声波温度60 ℃进行超声波提取，离心取上清液，减压浓缩，醇沉，冷冻干燥即得香菇菜粗多糖。

1.3.2 香菇菜中多糖含量测定

参照苯酚-硫酸法[25]测定多糖浓度，以A490nm为纵坐标，葡萄糖质量浓度（μg/mL）为横坐标，制作葡萄糖标准曲线，得A490nm与葡萄糖质量浓度关系的线性方程：y=0.014 9x-0.029 6，R2=0.999 2。多糖提取得率按式（1）计算。

式中：C为粗多糖质量浓度，μg/mL；V为粗多糖提取液体积，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.3.3 香菇菜中多糖提取单因素试验

经预试验，确定超声波时间、液料比、超声波功率、超声波温度为香菇菜多糖提取主要因素。以超声波时间45 min、液料比40∶1 mL/g、超声波功率300 W、超声波温度60 ℃为基础条件，控制基础工艺其他条件不变，进行单因素试验，考察超声波时间、液料比、超声波功率、超声波温度对香菇菜中多糖提取的影响。

驱动模块设计以直流电机和舵机为主，直流电机控制容易，舵机容易提供更大的扭力。相对于不同的障碍应选不同的电机和装配方式。通常情况下，六电机、[1]六轮式机器人具有越障能力高、承载能力强、结构和控制简单、转向灵活、工作效率高等优势。

1.3.4 响应面法优化香菇菜中多糖超声波提取工艺

采用Box-Behnken模型[26-27]，对超声波时间（A）、液料比（B）、超声波温度（C）和超声波功率（D）进行响应面试验设计，试验自变量因素水平如表1所示。

表1 试验自变量因素水平表

1.3.5 香菇菜中多糖抗氧化能力分析

配制合适浓度的香菇菜多糖溶液，不同浓度多糖的对二苯代苦味酰基（DPPH）自由基、羟自由基和2, 2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基的清除能力分别用南京建成生物工程研究所的测试盒方法进行检测。结果用Origin Pro软件进行数据处理，得出半数效应浓度EC50值。各自由基清除能力按式（2）～（4）计算。

1.3.6 香菇菜中多糖红外分析[28]

取1 mg多糖样品和100 mg KBr粉末混合，在红外灯下研磨均匀并压片，用红外光谱仪进行检测，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率16 cm-1，扫描10次。

2 结果分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对香菇菜中多糖提取得率的影响

固定超声波时间45 min、超声波功率300 W、超声波温度60 ℃，分析不同液料比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g）对香菇菜中多糖提取得率的影响，结果如图1所示。随着提取液的增加，多糖提取得率呈上升趋势，液料比50∶1 mL/g时得到最大提取得率。

图1 液料比对香菇菜中多糖提取得率的影响

2.1.2 超声波时间对香菇菜中多糖提取得率的影响

固定液料比40∶1 mL/g、超声波功率300 W、超声波温度60 ℃，分析不同超声波时间（15，30，45，60和75 min）对多糖提取得率的影响，结果如图2所示。随着提取时间的延长，多糖提取得率呈先上升后下降趋势，提取时间60 min时，提取得率最高。

图2 超声波时间对香菇菜中多糖提取得率的影响

2.1.3 超声波温度对香菇菜中多糖提取得率的影响

固定液料比40∶1 mL/g、超声波时间45 min、超声波功率300 W，分析不同超声波温度（30，40，50，60和70 ℃）对多糖提取得率的影响，结果如图3所示。多糖提取得率随温度呈先上升后下降趋势，温度为50 ℃时，提取得率最高。

图3 超声波温度对香菇菜中多糖提取得率的影响

2.1.4 超声波功率对香菇菜中多糖提取得率的影响

固定液料比40∶1 mL/g、超声波时间45 min、超声波温度60 ℃，分析不同超声波功率（100，200，300，400和500 W）对多糖提取得率的影响，结果如图4所示。多糖提取得率随超声波功率增加而提高，在功率400 W时达到提取得率最高。

图4 超声波功率对香菇菜中多糖提取得率的影响

2.2 响应面试验结果及分析

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken设计原理，以超声波时间、液料比、超声波功率、超声波温度4个因素为自变量，以香菇菜中多糖提取得率为响应值设计试验，结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计与结果（n=3）

由Design-Expert 8.0软件对试验结果进行二次多项回归拟合，二次多项回归方程为Y=6.14+0.15A-0.17B+0.20C+0.016D-0.050AB+0.23AC-0.13AD+0.16BC-0.052BD-0.25CD-0.66A2-0.41B2-0.60C2-1.03D2。根据回归模型方差分析结果（表3）可知，模型差异极显著（P＜0.000 1），失拟项差异不显著（P=0.064 9＞0.05），确定系数R2=0.993 5，校正系数Radj2=0.987 5，说明该模型对试验拟合度好，可对香菇菜中多糖提取得率进行分析、预测。因素A、B、C差异极显著（P＜0.01），D不显著（P=0.461 2＞0.05）。根据F值，各因素对香菇菜中多糖提取得率的影响主次顺序为超声波温度＞液料比＞超声波时间＞超声波功率。因素A2、B2、C2、D2、AC、AD、BC、CD对提取率均有极显著的影响（P＜0.01），因素AB、BD对提取得率的影响不显著（P＞0.05）。两因素交互作用如图5所示，各因素对多糖得率呈抛物线，两两之间均存在交互作用，有最大值存在[29]。

图5 试验因素间交互作用的响应面和等高线图

表3 回归模型方差分析

通过响应面法优化后的最佳工艺为超声波时间62.32 min、液料48.21∶1 mL/g、超声波温度51.75℃、超声波功率398.15 W，此时预测提取得率理论值为6.19%。为方便实际操作，选择最优工艺条件：超声波时间60 min、液料比50∶1 mL/g、超声波温度50℃、超声波功率400 W。根据最优工艺条件进行验证试验（n=3），得到的平均提取得率为6.18%，验证值与理论值非常接近，说明模型预测效果良好。

2.3 香菇菜中多糖抗氧化活性分析

2.3.1 香菇菜中多糖对DPPH自由基清除能力

由图6可知，香菇菜中提取的多糖与香菇柄中提取的多糖对DPPH·清除能力基本一致，说明香菇菜的热油炒制加工方式几乎不影响多糖对DPPH·的清除能力。随着香菇菜多糖浓度的增加，DPPH·清除能力逐渐增强。在0.031 25～1 mg/mL的多糖浓度范围内，DPPH·清除率由9.35%上升到84.41%，半数效应浓度EC50为0.57 mg/mL。在试验范围内，两者的清除能力均小于VC。

2.3.2 香菇菜中多糖对羟自由基清除能力

香菇菜中多糖对羟自由基（·OH）清除能力试验结果如图7所示。香菇菜中多糖对·OH有较强的清除能力，随浓度增加而增加，在0.125～2 mg/mL多糖范围内，·OH清除率由17.44%上升到92.29%，试验范围内最高可达93.61%，半数效应浓度EC50为0.33 mg/mL。但清除能力总体弱于香菇柄中多糖和VC，说明高温炒制加工方式可能影响多糖的结构，进而影响多糖对羟自由基的清除能力，具体机制需要进一步研究。

2.3.3 香菇菜中多糖对ABTS自由基清除能力

ABTS自由基（ABTS+·）在405 nm波长处有强吸收，清除剂存在时，吸收减弱或消失。试验结果表明，香菇菜中多糖对ABTS+·有一定清除能力（图8），在0.25～4 mg/mL的多糖浓度范围内，清除率由5.32%上升到68.73%，半数效应浓度EC50为1.35 mg/mL。总体上，香菇菜中多糖对ABTS自由基清除能力基本与香菇柄中多糖一致，两者均弱于VC。前者在较高浓度和较低浓度时，清除能力稍弱于后者，说明香菇菜加工方式对多糖的ABTS自由基清除能力有一定影响。

图8 多糖对ABTS自由基清除作用

2.4 香菇菜中多糖红外分析

从香菇菜多糖的红外光谱图（图9）可看出：3 212 cm-1处的吸收峰是多糖—OH的伸缩振动吸收峰，1 631 cm-1处的吸收峰是多糖—OH的弯曲振动吸收峰；2 909 cm-1和2 832 cm-1处C—H伸缩振动吸收峰及1 425 cm-1和1 380 cm-1处C—H变角振动吸收峰为香菇多糖的特征吸收峰，对应β-糖苷键相关振动；1 089 cm-1和1 037 cm-1处的吸收峰是由糖环上的C—O—C和C—O—H伸缩振动引起的，表明存在吡喃糖苷；892 cm-1处有明显的β-糖苷键吸收峰，表明多糖存在β-糖苷键；在521，497和475 cm-1处的吸收峰是CCO变形振动。

图9 香菇菜中多糖红外光谱图

从香菇柄多糖的红外光谱图（图10）可看出：3 219 cm-1处的吸收峰是多糖—OH的伸缩振动吸收峰，1 609 cm-1处的吸收峰是多糖—OH的弯曲振动吸收峰；2 919 cm-1和2 852 cm-1处C—H伸缩振动吸收峰及1 420 cm-1和1 375 cm-1处C—H变角振动吸收峰为香菇多糖的特征吸收峰，对应β-糖苷键相关振动。1 082 cm-1，1 043 cm-1处的吸收峰是由糖环上的C—O—C和C—O—H伸缩振动引起的，表明存在吡喃糖苷；893 cm-1处有明显的β-糖苷键吸收峰，表明多糖存在β-糖苷键；在522 cm-1和479 cm-1处的吸收峰是CCO变形振动。

图10 香菇柄中多糖红外光谱图

可见香菇菜中提取的多糖与香菇柄中提取的多糖红外光谱特征基本一致，说明香菇菜高温炒制加工方式对多糖结构和官能团影响较小。这与俞明君[30]的研究发现烹饪加工处理对香菇多糖的结构和官能团影响较小一致。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面法对香菇菜中多糖超声波提取工艺进行优化，通过DPPH·、·OH和ABTS+·清除试验评价多糖抗氧化能力，并采用红外光谱法对多糖结构进行检测。经Design-Expert软件分析并结合实际情况，选择液料比50∶1 mL/g、超声波时间60 min、超声波温度50 ℃、超声波功率400 W为最优工艺，该条件下多糖提取得率为6.18%。自由基清除试验表明，多糖对DPPH·、·OH和ABTS+·这3种自由基均有较好的清除能力，EC50值分别为0.57，0.33和1.35 mg/mL。高温炒制加工方式降低多糖对·OH清除能力，但对DPPH·、ABTS+·清除能力影响不大。经红外光谱鉴定，香菇菜中提取的多糖与香菇柄中提取的多糖红外光谱特征基本一致，说明香菇菜加工方式对多糖结构影响不大。试验为较复杂食品基质中提取多糖并进行抗氧化能力评价提供一定参考。