基于β-环糊精/壳聚糖/聚乙烯醇负载牛至油缓释膜的制备及其性能评价

马 源，唐善虎，李思宁，郝 刚，王健翔，骆卓伶，周海栋，廖彬旭，陈寒霜露

（西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041）

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）具有良好的成膜性、生物相容性以及可降解性等优点，已被广泛应用于食品[1-3]、生物医药[4-6]以及化工[7-8]等领域。但是，由于PVA结构中存在大量羟基，导致成膜材料疏水性较差[9]，大幅限制了其在食品包装领域中的应用。研究表明，壳聚糖（chitosan，CS）结构中的活性羟基和氨基与PVA中的羟基可形成分子间氢键[10]，能够有效解决PVA易溶于水的问题。Liu Yaowen等[1]发现PVA/CS薄膜相较于纯PVA薄膜呈现出低透氧性、高阻水性以及抗菌效果佳等特点；同时CS对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出较高的抗菌活性[11]；Bonilla等[12]报道将CS掺入PVA薄膜降低了薄膜的紫外线透射率，并且改善了薄膜的抗菌性能。由此可见，PVA/CS可以充当成膜基质，在食品包装行业具有较好的应用前景。

牛至油（oregano oil，OEO）是一种用途较为广泛的抗菌剂，尽管其成分会受到原产地、气候和环境等多种因素的综合影响[13]，但多项研究表明其主要成分为香芹酚和百里酚等，这赋予了其独特的气味以及优良的抗菌抗氧化能力，而较高浓度的OEO却会挥发出令人不适的刺鼻气味[14-16]。有报道称β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）作为一种缓释剂，可以适当掩盖精油的刺激气味，同时避免精油氧化或热降解，从而使精油能够更持久地发挥抗菌抗氧化能力[17]。

目前鲜有将含β-CD的精油加入PVA/CS薄膜中的报道。因此，本研究以PVA和CS作为成膜基质，以β-CD作为缓释剂，以OEO作为抗菌剂，采用流延法制备具有抗菌抗氧化功能的OEO缓释膜，并通过傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）图、静态水接触角（water content angle，WCA）、热稳定性、力学性能以及光阻隔性能等指标分别评估β-CD/CS/PVA复合膜中不同组分之间的相互作用以及不同体积分数OEO缓释膜的理化性能；此外，研究复合膜的抗菌和抗氧化性能及在各种食品模拟液中的释放行为，从而分析不同体积分数OEO对β-CD/CS/PVA薄膜的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213和大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 51459由北京北纳创联生物技术研究院提供。

OEO、1799型PVA（醇解度98%～99%）（均为分析纯）上海麦克林生化科技有限公司；β-CD（生物试剂）成都市科龙化工试剂厂；CS（生物试剂，脱乙酰度90%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（98%）上海源叶生物科技有限公司；冰乙酸、无水乙醇、丙三醇、吐温-80（分析纯）成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

HMS-203D加热型磁力搅拌器 上海沪析实业有限公司；T-25 digital高速分散机 德国IKA公司；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV1810S紫外-可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；LR 64912C FTIR仪 美国PerkinElmer公司；OCA-20接触角测量仪 德国Dataphysics公司；5967电子万能材料试验机 美国Instron公司。

1.3 方法

1.3.1 复合膜的制备

1.3.1.1β-CD/CS/PVA复合膜液的制备

取5 g PVA和0.7 gβ-CD溶于100 mL去离子水中，并于磁力搅拌器中以85 ℃、400 r/min搅拌1.5 h至完全溶解，得到0.05 g/mL PVA/β-CD溶液。

取2 g CS溶于100 mL 2%（体积分数，下同）冰乙酸，以60 ℃、350 r/min磁力搅拌4 h，得到0.02 g/mL CS冰乙酸溶液。随后，将上述两种溶液按体积比1∶1混合并加入1.6 g甘油，高速搅拌1 h使其混合均匀，得到β-CD/CS/PVA复合膜液。

1.3.1.2 OEO/β-CD/CS/PVA复合膜液的制备

将不同体积OEO（0.2、0.4、0.6、0.8 mL）分别加入40 mLβ-CD/CS/PVA溶液中，并加入20 μL吐温-80用以乳化OEO，10 000 r/min均质5 min，随后4 ℃离心（2 000 r/min）消泡5 min，即得到OEO体积分数分别为0.5%、1%、1.5%、2%的OEO/β-CD/CS/PVA成膜液。

1.3.1.3 复合膜的制备

采用流延法成膜[18]，干燥、揭膜后平衡48 h备用。由于所有膜样品中均添加了β-CD，因此为方便记录，PVA/β-CD膜、β-CD/CS/PVA膜以及含不同OEO体积分数（0.5%、1%、1.5%、2%）的OEO/β-CD/CS/PVA缓释膜分别记为P、CP、CP-O0.5%、CP-O1%、CP-O1.5%以及CP-O2%。

1.3.2 FTIR分析

参考Liu Liming等[18]的方法并稍加修改。借助FTIR仪测定复合膜在4 000～500 cm-1范围内的透射率。设置参数为：分辨率4 cm-1，扫描16 次。

1.3.3 表面润湿性分析

参考Liu Liming等[18]的方法并稍加修改。在25 ℃条件下吸取1 µL双蒸馏水滴加到复合膜表面，待稳定后测定其WCA。

1.3.4 热稳定性的测定

采用差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）测定复合膜的热稳定性，参考张星晖等[19]的方法并稍加修改。称取5.00 mg复合膜置于铝坩埚中，压盖密封，以空坩锅为对照。在50 mL/min的氮气条件下，以10 ℃/min的恒定速率在30～150 ℃范围内升温，测定复合膜的热稳定性。

1.3.5 水分质量分数的测定

将薄膜样品裁剪成2 cm×2 cm的小正方形，称质量记为m0/g。将其放置于铝盒中，在105 ℃的烘箱中干燥24 h至恒质量，记为m1/g。水分质量分数按式（1）计算。

1.3.6 力学性能的测定

参考高素利[20]的方法并稍加修改。将复合膜裁剪为3 cm×2 cm的长条状，夹在电子万能材料试验机两端的夹具上。设定参数为：初始夹持间距为15 mm，拉伸速率为20 mm/min。拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EB）分别按式（2）、（3）计算。

式中：T为样品断裂时所受最大力/N；S为样品横截面积/mm2，即样品宽度/mm×样品厚度/mm。

式中：L0为初始夹具间距/mm；L为样品断裂时夹具间距/mm。

1.3.7 光学性能的测定

参考黄宸等[21]的方法并稍加修改。将复合膜裁剪成合适尺寸的小矩形，紧贴石英比色皿一侧内壁，以空白比色皿作为对照，借助紫外-可见分光光度计测定复合膜在600 nm波长处的吸光度，并按式（4）计算不透明度。

式中：A600nm为膜在600 nm波长处的吸光度；d为膜厚度/mm。

1.3.8 抗菌性能的测定

分别以E.coli和S.aureus作为典型的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，吸取100 μL菌液涂布至琼脂肉汤平板，将直径6 mm的滤纸片（已于成膜液中浸泡6 h）贴在培养基表面，置于培养箱中37 ℃培养10 h，测定其抑菌圈直径，从而评价复合膜的抑菌性能。

1.3.9 抗氧化性能的测定

参考梁杰等[22]的方法并稍加修改，通过测定DPPH自由基清除率评价膜的抗氧化性能。将薄膜裁剪成2 cm×2 cm，加入装有30 mL蒸馏水的锥形瓶中，放置于摇床30 ℃下以110 r/min振摇48 h，使复合膜中的活性物质充分释放，取上清液待用。取2 mL上清液至比色管中，加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混匀后于室温下避光反应40 min，随后5 000 r/min、4 ℃离心10 min。以无水乙醇作为参比，测定样品上清液在517 nm波长处的吸光度，每组样品平行测定3 次。按式（5）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为2 mL H2O＋2 mL DPPH溶液的吸光度；A1为2 mL上清液＋2 mL DPPH溶液的吸光度；A2为2 mL上清液＋2 mL无水乙醇的吸光度。

1.3.10 复合膜缓释效果评价

参考Lian Huan等[23]的方法并稍加修改，采用蒸馏水、50%乙醇溶液、95%乙醇溶液3 种食品模拟液分别作为水基食品、水包油乳状液、酒精食品和脂肪食品模拟物。将2 cm×2 cm的薄膜浸入盛有50 mL食品模拟液的烧杯中，每隔一段时间移取3 mL浸泡液采用紫外-可见分光光度计测定277 nm波长处吸光度（测完后迅速将浸泡液移回烧杯）。待吸光度数值恒定后，将膜绞碎并置于磁力搅拌器600 r/min搅拌24 h，使OEO充分释放，测定溶液在277 nm波长处的吸光度，从而计算OEO最大释放量。同时，根据标准曲线计算OEO的释放量（经全波长扫描，OEO的最大吸收波长为277 nm，OEO在1.95～125 nL/mL范围内的标准曲线方程为y＝14.501x＋0.008 9，R2＝0.999 5），从而计算不同时间点OEO的释放率。以时间为横坐标、OEO释放率为纵坐标，绘制复合膜在3 种模拟液中的缓释曲线。

1.4 数据统计与分析

所有数据以平均值±标准差表示，显著性均采用SPSS 26.0软件中的单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan法进行多重比较，以P＜0.05表示差异显著；采用Origin 2022软件绘图。

2 结果与分析

2.1 复合膜的FTIR结果分析

FTIR图谱可以反映物质的化学键和官能团等独特的结构信息，本研究采用FTIR分析了不同体积分数OEO对β-CD/CS/PVA复合膜结构的影响（图1）。PVA膜中引入CS、OEO后，并无特征吸收峰产生或消失，仅表现出了峰强度的增强或减弱，说明其结构并未发生明显变化，几种成分彼此之间有良好的相容性。

图1 复合膜的FTIR图谱Fig.1 FTIR spectra of composite films

在PVA图谱中，3 273 cm-1处的宽峰是大量羟基伸缩振动所造成的；加入CS后，该峰向左略微偏移且峰强度也发生了细微的变化。其原因可能是PVA和CS的质量浓度太大，二者发生缔合，导致PVA的游离羟基与CS的羟基和氨基结合形成了氢键[24-25]。此外，2 929 cm-1处的吸收峰由—CH2的伸缩振动引起[26]，1 417 cm-1处的吸收峰由β-CD中O—H的特征弯曲振动引起[27]，835 cm-1处则是由C—C键的伸缩振动引起[28]。本研究中所有复合膜样品在1 031～1 029 cm-1处均产生了特征峰，这归因于膜制备的过程中均加入了甘油[29]。

2.2 复合膜的WCA结果分析

WCA通常被用来评价复合膜的亲水性，大于90°为疏水，反之则为亲水。由图2可知，所有复合膜均具有亲水性，但是各处理组亲水程度不同，这是由于PVA、CS、β-CD、甘油以及吐温-80都具有亲水性，而OEO具有一些疏水基团导致的。

图2 复合膜的表面润湿性Fig.2 Surface wettability of composite films

加入CS后，复合膜的WCA显著增大（P＜0.05），这意味着其疏水性增强，可能是PVA与CS之间缔合形成了氢键。引入OEO后，复合膜的WCA下降，这是由于乳化OEO的吐温-80具有强亲水性，多余的—OH同水分子结合使薄膜亲水性增强[30]，导致复合膜疏水性骤降；但随着OEO添加量的增加，复合膜的WCA逐渐回升，在OEO体积分数为2%时达到62.15°，这是OEO中疏水基团（—CH3、—CH2和—CH）共同作用导致的[31]，说明OEO的加入可以显著提高复合膜的疏水性（P＜0.05）。在食品包装中，提高复合膜的疏水性有助于阻挡空气中的水蒸气，从而延长食品货架期。

2.3 复合膜的DSC结果分析

通过DSC监测不同复合膜的熔融温度可以分析其热稳定性。由图3可知，在6 种复合膜中均只观察到单一吸热峰，表明这几种组分彼此之间具有良好的相容性[32]。此外，PVA膜在86.33 ℃处表现出吸热熔融转变；而加入CS之后熔融温度升高，这可能是因为PVA和CS分子间缔合形成了氢键，从而抑制了PVA分子链的运动，提高了复合薄膜的熔融温度，这与FTIR以及WCA的结果相印证。

图3 复合膜的热稳定性Fig.3 Thermal stability of composite films

加入OEO后，熔融峰的出现位置并未随着添加量的增加表现出一定的规律，其热稳定性由高到低依次为CP-O1%＞CP-O2%＞CP-O0.5%＝CP-O1.5%，这可能与吐温-80的乳化能力有关。当OEO体积分数为1%时，复合膜液中的吐温-80可充分乳化OEO，此时整个体系处于平衡态，复合膜液整体稳定性提高，因此熔融温度最高；当OEO体积分数为0.5%时，未完全乳化的吐温-80游离在水相中，与水分子通过共价键相连接，导致其结合水的能力强于其余处理组；当OEO体积分数大于1%时，复合膜中的吐温-80已达乳化饱和，导致多余的OEO悬浮于复合膜液中，溶液的整体稳定性下降，熔融温度也随之降低，未参与乳化的OEO增强了复合膜的疏水性。

2.4 复合膜的水分质量分数分析

水分质量分数是反映复合膜耐水性的重要指标。如图4所示，PVA膜的水分质量分数较高，当引入CS后，复合膜的水分质量分数有所下降，这意味着PVA与CS之间形成了氢键，从而抑制了水分子之间的交联[10]。而加入少量OEO后，复合膜的水分质量分数有所回升，这是由于与OEO一并加入的吐温-80具有较高的亲水性[30]；但随着OEO体积分数的增加，复合膜的水分质量分数有所下降，这是由于OEO结构中含有部分疏水性官能团[31]。上述结果与复合膜的WCA呈现出相反的趋势，所得结论可相互印证。

图4 复合膜的水分质量分数Fig.4 Water contents of composite films

2.5 复合膜的力学性能分析

TS与EB常被用来评判薄膜的力学性能。如图5所示，在PVA膜中引入CS后，其TS显著增大（P＜0.05），而EB显著减小（P＜0.05）；在CP中加入少量的OEO时，其TS和EB均显著减小。随着OEO体积分数的增加，复合膜的TS先降低后增加：当OEO体积分数增加至1.5%时，TS呈现出减小的趋势，这可能归因于OEO中弱的油-聚合物键部分取代强的聚合物-聚合物键，导致复合膜网络状结构被削弱或破坏[33]；当OEO体积分数从1.5%增加到2%时，复合膜的TS由4.50 MPa显著增加到9.48 MPa（P＜0.05），这与Mohsenabadi等[34]发现迷迭香精油-淀粉-羧甲基纤维素薄膜的TS随着精油浓度增加先降低后增加的结果相吻合。复合膜的EB随着OEO体积分数的增加而显著增大（P＜0.05），说明OEO的引入可有效提高复合膜的延展性。

图5 复合膜的力学性能Fig.5 Mechanical properties of composite films

2.6 复合膜的光学性能分析

图6是不同复合膜在600 nm波长处的不透明度。其中，PVA膜的不透明度最低，仅为0.310；引入CS后薄膜的光阻隔性能显著提高（P＜0.05），这是CS的引入使复合膜的颜色由无色转变为淡黄色而引起的。添加OEO后，薄膜的不透明度随着OEO体积分数的增加显著提高（P＜0.05），这可能与OEO均匀分散在薄膜中致使光线被阻挡有关。CP-O2%组在600 nm波长处的光阻隔性能最好，其不透明度高达2.154，说明其可以更有效地抑制阳光直射造成的食品氧化。

图6 复合膜的光学性能Fig.6 Optical properties of composite films

2.7 复合膜的抗菌性评价

为评价复合膜的抗菌效果，以E.coli和S.aureus为菌种，借助琼脂纸片扩散法观察其抑菌圈大小。如图7所示，PVA膜并不具备抑菌作用，而CP也仅对E.coli有微弱的抗菌效果。随着OEO体积分数的增加，复合膜对两种菌的抑菌作用均显著增强（P＜0.05），这是由于OEO中的酚类物质赋予了复合膜优良的抗菌活性[15]；其中，CP-O2%组的抑菌效果最好，其对S.aureus和E.coli的抑菌圈直径分别达到8.42 mm和9.24 mm。此外，本研究发现添加OEO后复合膜对E.coli的抑菌效果要高于S.aureus，这与赵海伊[35]的研究结果一致。

图7 复合膜的抗菌效果Fig.7 Antibacterial effect of composite films

2.8 复合膜的抗氧化性评价

通常DPPH自由基清除率越高表明复合膜的抗氧化能力越好。如图8所示，PVA膜的DPPH自由基清除率仅为3.01%，表明其几乎没有抗氧化能力；引入CS后，复合膜的抗氧化能力显著提高（P＜0.05），这归因于CS结构中—NH2提供的氢原子可与DPPH自由基结合形成稳定的DPPH-H结构，从而延缓了自由基链式反应[36]。此外，随着OEO体积分数的增加，复合膜的DPPH自由基清除率也显著升高（P＜0.05），CP-O2%复合膜的DPPH自由基清除率达80.84%，说明添加OEO可以显著提升复合膜的抗氧化能力；这是OEO中的百里酚和香芹酚等酚类物质所发挥的作用，这些成分能够延缓食品中的脂质过氧化进程，同时加快自由基的清除速率[31]。作为一种抗氧化薄膜，CP-O2%可有效延长乳类、肉类、蛋类以及各种油类等食品的贮藏期，从而更好地保证食品质量。

图8 复合膜的抗氧化能力Fig.8 Antioxidant capacity of composite films

2.9 复合膜的缓释效果分析

由于食品包装与食物之间的接触是不可避免的，因而在接触过程中复合膜中的活性物质会逐渐释放到食品表面，因此有必要研究复合膜在各种食品模拟液中的释放曲线[37-38]。如图9所示，在3 种体系中，OEO中的活性物质从复合膜上逐步释放至食品模拟液中，直至达到动态平衡状态；各复合膜的OEO释放曲线相似，即前期OEO释放较快，后期OEO释放较为缓慢。

图9 复合膜在不同体系的缓释效果Fig.9 Sustained release levels of composite films in different systems

添加不同OEO体积分数的复合膜在3 种介质中的释放曲线均呈现出了相似的趋势，其释放率由快至慢依次为50%乙醇溶液＞水＞95%乙醇溶液，这与Lian Huan等[23]的研究结果相似，他们发现在3 种介质中，CS-百里香精油复合膜中的精油在50%乙醇溶液中释放最快，在95%乙醇溶液中释放最慢。产生这种现象的原因可能是由于50%乙醇溶液对复合膜的浸润性较高，从而可以明显减弱OEO小分子与复合膜大分子之间的结合力，使得OEO释放较快[39]。此外，β-CD作为一种亲水性的缓释剂，也是促进水分子扩散到基质中的水合剂，因而对精油在水和50%乙醇溶液中的快速释放也起了一定的促进作用[40]。复合膜在95%乙醇溶液中OEO缓慢释放，在该体系中CP-O0.5%和CP-O1.5%这两种复合膜可以持续释放540 min，CP-O1%中的OEO可以持续释放480 min，CP-O2%虽在240 min时释放率达到动态平衡状态，但仍优于其在其他两种体系中的缓释效果。上述结果充分说明CP-O0.5%和CP-O1.5%可以作为95%乙醇溶液体系中的缓释材料。

3 结论

本研究以PVA和CS作为成膜基质，β-CD为缓释材料，OEO为抗菌抗氧化剂，采用流延法成功制备出了一种兼具抗菌和抗氧化效果的缓释膜。分析了复合膜的理化结构、机械性能、疏水特性、热稳定性和光阻隔性能，并通过琼脂纸片扩散法以及DPPH自由基清除率分析分别评估了复合膜的抗菌和抗氧化能力，最后通过模拟复合膜在3 种食品模拟液中的迁移探讨了其缓释性能。

本研究结果显示，复合膜的不同组分之间具有良好的相容性，OEO的加入并未改变其化学结构；当OEO体积分数为2%时，复合膜具有最佳的光阻隔能力、疏水性能、抗菌和抗氧化能力，并展现出良好的力学性能和热稳定性；不同OEO体积分数的缓释膜均在95%乙醇溶液中呈现出良好的缓释效果，在该介质中CP-O0.5%和CP-O1.5%中的OEO可持续释放540 min。

综上，本研究所开发的复合膜性能优良，并且具有良好的抗菌抗氧化性能，在食品包装领域具有广阔的应用前景。今后仍需进一步对复合膜的力学性能和疏水性能进行改良，使其可应用于更多的食品中。