在蛋白质化学检测方法食品安全评估和检测中的应用

黄章程

（福建赛福食品检测研究所有限公司，福建福州 350100）

民以食为天，当食品发生安全问题后不仅会使社会的诚信机制受到消极影响，严重时还会使广大人民群众的生命安全遭遇威胁。进入新时代后，为了有效保障食品安全，提升全民素质，完善了原有的食品安全国家标准体系。但是，在实施过程中并不能从根本上杜绝部分商家通过非法手段从事制假、掺假、售假等违法犯罪活动。因而，在当前阶段十分有必要加强对食品安全评估和检测的研讨，利用先进的检测方法提高其评估和检测效率及质量，为食品安全管理提供技术支撑等。

1 蛋白质化学检测方法的基本原理

蛋白质属于大分子化合物，由氨基酸脱水而来。化学组成元素包括了C、O、N、H、S、P 及微量元素等（图1），理化特性如下：①氨基酸特性；②高分子性质；③水合作用；④显色反应等。近几年蛋白质化学检测中应用的方法主要有两种，一种是凯氏定氮法，另一种是高效液相色谱法，两种方法不仅在检测原理方面存在较大差异，而且适用范围有所不同。

图1 蛋白质组成元素及含量示意

1.1 以凯氏定氮法为例

该方法已有一百多年的历史，具有可靠性高、应用广泛的特点。从全球范围看，多数国家、专业检验检测机构，都将其作为蛋白质检测方面的标准方法，有效落实到了食品安全评估和检测之中。目前，我国在食品安全评估和检测中，将其作为国家标准、行业标准中的重要方法对其进行了推广应用。从原理方面看，凯氏定氮法包括消化、蒸馏、滴定。具体如下：①消化环节主要是在氧化反应的条件下把被测样品中的含氮化合物转化氨气，同时以硫酸铵的形式分离出其中的氮元素。②蒸馏环节主要是把氨从消化产物中分离出来，并通过滴定方式定量分析溶液内的氨离子。消化、蒸馏、滴定三大检测步骤对应的化学反应式如下：

1.2 以高效液相色谱法为例

高效液相色谱法（HPLC）属于色谱法，主要是在经典液相色谱法基础上发展出来的新型检测方法，优势集中表现在应用范围大、分离速率高、准确度高、灵敏度高等方面，尤其在挥发性化合物、高沸点化合物检测方面具有较好的应用效果。目前，在国内的食品检测、环境监测方面，对其进行了推广应用。从原理方面看，该方法主要是从物化性质差异出发，以液体作为流动相，利用高压输液系统、物质溶解度、物质蒸气压等，分离物质流动相和固定相色谱柱中的物质组分。以液相色谱柱分离为例，假定分布系数、分离因子分别为a和k，可以根据公式对n个液相色谱柱的分离效率R进行有效计算。具体如下：

2 食品安全评估和检测中对蛋白质化学检测方法的应用

自《食品安全标准与监测评估“十四五”规划》实施至今，国家食品安全管理部门、监督部门、专业检验检测机构，在食品安全评估和检测中普遍加强了对凯氏定氮法和高效液相色谱法的应用，虽然蛋白质检测中的两种方法原理、优势、劣势均存在差异（表1），但是在实际应用中可以满足大部分食品安全精准检测需求。为了论述的清晰性，下面仅对凯氏定氮法的应用展开具体说明。

表1 蛋白质检测方法原理及优势和劣势

2.1 应用现状

目前，应用凯氏定氮法时主要是对食品中的蛋白质进行质量检测。但是，当参考值存在较大不确定性时，不能将该方法作为替代方法实现对测定对象的准确评估。例如，应用该方法建立参考值的过程中，要求检测人员对凯氏定氮法的性能做进一步验证，并对其期望范围进行确认。事实上，应用该方法时牵涉三大检测步骤，每个步骤中的化学反应比较复杂，通常的测量时间不低于10 h，并不能满足当前阶段食品安全评估和检测中对快速测定的要求。为了解决该问题，在离子色谱、凯氏消化方面，可以使用抑制电导检测方法，进而使消解时间降至1 h 以内，同时省去该方法中的其他两个步骤，进而使分析时间大幅度降低，达到食品安全评估和检测中对其准确度和精密度的要求。再如，部分不良商家为了牟取暴利，会选择在食品中掺假牛奶生乳蛋白，此时检测人员可以利用非蛋白质氮（NPN）指数概念，将该方法与三氯乙酸沉淀法（TCA）进行联合应用，完成对一系列牛奶样品非蛋白质氮和蛋白质氮的检测。以三聚氰胺为例，当掺假牛奶中的含量小于0.2 mg/kg 时NPN 指数可达到可辨识范围（最小值为0.8084，最大值为1.4987）。检测人员可以根据该条件，应用上述两种方法的联合检测方式，更为精准地完成对富含氮的掺假牛奶质量检测工作。

2.2 实验分析

2.2.1 实验材料

仪器主要包括UV-1800紫外可见分光光度计，石墨消解仪。试剂如下：实验试剂为聚乙烯醇，基准物为氯化铵、碳酸钠，分析纯包括过氧化氢（30%），溴甲酚绿，甲基红，盐酸，氢氧化钠，硼酸，硫酸铜、硫酸钾，硫酸，碘化汞（CP），碘化钾。实验食品共计7种，分别为清蒸猪肉、原法鲭鱼、蚕豆、午餐肉、红烧肉、咖啡鸡、菜籽粕。

2.2.2 实验方法

首先，实验人员按0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、2.8 mL、4.0 mL，吸取含N 量为40 mg/mL 的标准氯化铵溶液，通过聚乙烯醇液（0.1 mg/mL）对其进行稀释处理后，量取奈氏试剂1 mL，加入稀释液，加入量以25 mL 为准，然后采用比色法在460 nm 位置进行比色，获取蛋白质过氧化凯氏定氮法标准曲线y=0.034 2x+0.121 6，R2=0.9989。

其次，采用电子天平秤取0.25 g 样品，将其置于凯氏定氮管中，然后添加硫酸4 mL，置于石墨消解仪上300℃加热3 min 后，以2 mL/min 的速度添加消化剂15 mL（过氧化氢和硫酸比例为4：1）继续在石墨消解仪上350℃温度加热2 min，完成对过氧化剂的处理后，取出消解管，冷却后转移并定容至100 mL。按照比色法吸取0.4 mL 样品进行比色。

第三，根据GB 5009.5—2016标准要求，应用过氧化凯氏定氮法对样品中的蛋白质含量进行测定。为了说明该方法的测定优势，实验人员同时应用常规凯氏定氮法对样品中的蛋白质进行了测定，记录了相关测定数据，比较了常规法、过氧化法的精密度等。

2.2.3 实验结果和讨论

实验结果显示，在7 个样品中，应用过氧化法测定的蛋白质含量在37.62%～38.71%，CV 为0.44%。常规法测定下的对应数据为28.0%～38.5%、0.53%。应用F 检验比较后发现，两种方法的精密度不具有显著差异，基本相同。但是，通过对清蒸猪肉、原法鲭鱼、蚕豆、午餐肉、红烧肉、咖啡鸡、菜籽粕七种食品的蛋白质含量测定后，发现二者的对应差值，分别为+0.19、+0.73、+0.16、+0.38、-0.45、+0.70、-22。根据数理统计理论，对两种方法进行比较分析：①当测定次数增多后，两种方法测定值减差值应等于0；②在有限测定次数内，二者的减值不一定等于0，而且与0之间不存在显著差异。对应到统计检验方面，检验假定条件是H0：u=u0，备样假设条件为H1：u≠u0。假定显著性水平α=0.05，那么，本例中的拒绝域|t|＞t0.05，6=2.45，由此说明检验假定条件成立，两种方法的测定结果趋于一致。

但是，在测定结果影响方面，应用过氧化剂（ 按0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）后，消化时间在2.5～15.0 min，蛋白质含量范围在27.98%～29.98%。经过比较发现，当过氧化剂使用量为5 mL，滴速为2 mL/min 时，菜籽粕蛋白质量含量测定结果方面，基本趋于恒定。对其他样品进行测定后，发现15 mL 的过氧试剂应用效果相对较好，在滴速不变的情况下消化时间约在7.5 min。从样品氮回收率方面看，硫酸与过氧化氢发生反应后，主要生成的水和HS03OOH 的，根据文献报道和本次实验经验看，按4：1的比例应用30%过氧化氢和氧化剂硫酸，能够起到较好的氧化效果，加速消化速度。

2.2.4 实验结论

通过实验结果与讨论说明，在食品蛋白质含量测定中，应用过氧化法，有利于提高凯氏定氮法的应用效率，实用性相对较高。

3 结束语

食品安全评估和检测在当前阶段已变得十分重要，成为食品安全国家标准体系的核心内容。建议在实践中选择蛋白质化学检测方法时，先对不同方法下的基本原则全面分析，再根据不同方法的适用范围对其进行应用。建议在食品评估和检测实践中，一方面选择凯氏定氮法对食品蛋白质质量进行检测，另一方根据面高效液相色谱法的适用范围，将其应用到对食品蛋白质含量检测方面，进而提高该方法的应用效果。