基于代谢组学研究红曲霉奶酪的代谢产物特征

徐杏敏，郑远荣，刘振民,*，孙 嘉，贾向飞

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海乳业生物工程技术研究中心，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436）

随着国人生活水平的提升和西方饮食文化的融入，我国霉菌奶酪市场有逐渐增长的趋势。发酵菌株的选择对奶酪品质的影响至关重要，目前用于奶酪成熟的霉菌主要是青霉和白霉，但此类产品并不完全符合国人口味。青霉奶酪通常蛋白水解及脂肪分解的程度较高，产品含盐量高且入口刺激辛辣[1]。白霉奶酪是表面覆盖白色真菌的软质奶酪，常见的有布里奶酪、卡蒙贝尔奶酪，奶味浓郁，但是带有一定霉味、菌菇味，与中国传统饮食的口味存在一定差异。因此，有必要尝试使用其他种类的霉菌进行奶酪制作，以研制更加适合国人口味的霉菌奶酪。我国拥有许多历史悠久的可食用菌株，红曲霉便是其中一种，常用于大米、豆腐等食品的加工，已被长期食用，具有一定食用安全性，所以具备加工奶酪的潜力。此外，红曲霉还可以产生红曲色素、γ-氨基丁酸、莫纳可林K 及其他生物活性化合物，有望用于生物功能乳制品的开发。迄今为止，已有研究者成功将红曲霉用于加工霉菌成熟奶酪，开发了红曲霉类卡蒙贝尔干酪[2]、红纹奶酪[3]，在此基础上优化加工工艺，开发出软质[4]、半软质、硬质等不同质地的红曲霉奶酪。红曲霉奶酪是一款新型霉菌成熟奶酪，其滋、气味较国外部分霉菌成熟奶酪（例如：蓝纹奶酪）更加温和，具有实现产业化的潜力。虽然研究人员对红曲霉奶酪开展了一系列的研究，包括对奶酪成熟期间理化性质、蛋白水解、挥发性及非挥发性风味物质的种类及变化等[5-7]。然而，目前暂无对红曲霉奶酪特征代谢产物的相关研究报道。随着红曲霉奶酪产业化的推进，急需研究红曲霉奶酪这一品类的代谢产物特征，探究红曲霉奶酪与其他霉菌成熟干酪的具体差异，分析差异代谢通路，为后续产品的改进及有益代谢产物的富集提供理论依据。

红曲霉菌株BC20 与ZX-99 是本实验室优选出的两株可用于制作霉菌干酪的优良菌株，利用它们制作的奶酪具有良好的风味，且奶酪中桔霉素含量低于国标检测限（25 μg/kg）[8]，食用安全。此外，青霉奶酪和白霉奶酪是最具代表性的霉菌成熟奶酪。因此，本研究以红曲霉奶酪BC20、红曲霉奶酪ZX-99 为实验样品，以接受度较高的一款市售青霉奶酪（蓝纹奶酪）、一款市售白霉奶酪（布里奶酪）作为对照样品。通过非靶向代谢组学的方法来表征4 款奶酪中的低分子量代谢产物，通过差异分析初步推断出属于红曲霉奶酪的代谢产物特征，并分析红曲霉奶酪的特征差异代谢通路，为之后定义红曲霉奶酪以及红曲霉奶酪的风味调控、有益代谢产物富集提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生牛乳、稀奶油 光明乳业股份有限公司；商业发酵剂FLORA、STI-13 科汉森（中国）有限公司；凝乳酶（酶活力：890 IMCU/g） 北京多爱特生物科技有限公司；红曲霉菌株BC20、ZX-99 乳业生物技术国家重点实验室；琪雷萨蓝纹奶酪（生产日期：2021 年11 月16 日） 丹麦阿尔乐公司；法兰希布里奶酪（生产日期：2021 年8 月26 日） 西诺迪斯食品（上海）有限公司；乙腈 美国Merck 公司；乙酸铵美国Sigma 公司；甲醇、氨水 美国Fisher 公司。

1300 系列A2 型生物安全柜 美国Thermo Scientific 公司；PRACTUM124-1CN 电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；HVE-50 高压蒸汽灭菌锅日本HIRAYAMA 公司；奶酪槽 英国Armfiled公司；HPP 110 奶酪成熟箱 德国MEMMERT 公司；QT-1 Votex 振荡器 上海琪特分析仪器有限公司；JY92-II 超声破碎仪、SCIENTZ-1LS 离心浓缩仪宁波新芝生物科技股份有限公司；5430R 低温高速离心机 上海比朗仪器制造有限公司；Vanquish LC 超高效液相色谱系统、Q Exactive 系列Orbitrap Exploris 480 质谱仪 美国Thermo 公司；ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱（柱1.7 μm，2.1 mm×100 mm column） 美国Waters 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 奶酪的制作 根据徐杏敏等[9]方法，使用菌株BC20 与ZX-99 进行红曲霉奶酪的制备与取样。工艺流程：原料乳标准化→杀菌并冷却→添加商业发酵剂→添加凝乳酶→凝乳后切割→装模成型→盐水腌渍→晾干→涂抹红曲霉发酵液→成熟。取样方式：整块奶酪表皮与内部混合均匀后取样。

1.2.2 样品前处理 奶酪样品在4 ℃环境下缓慢解冻后，取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1，v/v/v），涡旋混合，4 ℃、40 kHz 超声20 min，-20 ℃静置10 min，14000×g 4 ℃离心20 min，取上清真空干燥（2000 r/min，15 ℃，真空度小于50 Pa），质谱分析时加入100 μL 乙腈水溶液（乙腈:水=1:1，v/v）复溶，涡旋，14000×g 4 ℃离心15 min，取上清液进样分析。

1.2.3 色谱条件 参考ZHANG 等[10]方法，采用超高效液相色谱系统（UHPLC）HILIC 色谱柱将奶酪样品进行分离，柱温25 ℃，流速0.3 mL/min，进样量2 μL，流动相A 为水+25 mmol/L 乙酸铵+25 mmol/L氨水，流动相B 为乙腈。梯度洗脱程序：0～1.5 min，98% B；1.5～12 min，B 从98%线性变化至2%；12～14 min，2% B；14～14.1 min，B 从2%线性变化至98%；14.1～17 min，98% B；进样器温度4 ℃。

1.2.4 质谱条件 采用电喷雾电离（Electron spray ionization，ESI）正离子和负离子模式对样品进行检测。ESI 源及质谱设置参数如下：雾化气辅助加热气1（Gas1）：60，辅助加热气2（Gas2）：60，气帘气（CUR）：30 psi，离子源温度：600 ℃，喷雾电压（ISVF）±5500 V（正负两种模式）；一级质荷比检测范围：80～1200 Da，分辨率：60000，扫描累积时间：100 ms，二级采用分段式采集方法，扫描范围是70～1200 Da，二级分辨率：30000，扫描累积时间：50 ms，动态排除时间：4 s。

1.3 数据处理

采用XCMS 软件分析由UHPLC-Q-Exactive/MS得到的原始数据，对数据的完整性进行检查，去除组内缺失值超过50%的代谢物，不参与后续分析，删除极值，并对数据进行总峰面积归一化，以确保各样本间和代谢物间可平行性比较。SIMCA 14.1 软件进行多维统计分析（数据经Pareto-scaling 预处理），SPSS 26.0 进行t检验显著分析，火山图及热图由生信平台（https://bio-cloud.aptbiotech.com/）绘制，火山图在中标记的散点由Inkscape 软件进行标注。单维统计分析及其余数据由EXCEL 处理。根据 OPLSDA 模型获得的变量权重值（Variable importance for the projection，VIP），将P<0.05，VIP>1，差异倍数（Fold change，FC）>2 或<0.5 的代谢物定义为显著差异代谢物。每种样品重复检测6 次。

2 结果与分析

2.1 不同霉菌奶酪的代谢表型分析

为研究红曲霉奶酪与其他霉菌成熟奶酪（青霉奶酪、白霉奶酪）不同的特征代谢产物，利用UHPLCQ-Exactive/MS 对两款不同红曲霉菌株所制备的红曲霉奶酪、一款市售青霉奶酪、一款市售白霉奶酪的可溶性化合物成分及相对含量进行分析鉴定。在正离子模式（Positive ion mode，POS）与负离子模式（Negative ion mode，NEG）下，检测到16841 个四款奶酪样品中共有的代谢物离子特征，其中正离子模式下鉴定到1411 个代谢物、负离子模式下鉴定到1099 个代谢物。将鉴定到的所有代谢物根据其化学分类归属信息进行分类统计，各类代谢物数量所占比例如图1 所示。

图1 合并正负离子鉴定到的代谢物在各化学分类的数量占比Fig.1 Proportion of metabolites identified by combining positive and negative ions in each chemical classification

其中，占比前3 类物质分别是有机酸及其衍生物（Organic acids and derivatives），脂质和类脂分子（Lipids and lipid-like molecules），有机杂环化合物（Organoheterocyclic compounds），共计占比65.703%。有机酸类物质广泛存在于果蔬类食物中，主要提供果味、酸味，同时是一类安全的抗血栓因子，对防治心脑血管疾病具一定积极作用[11]，能够提高奶酪的风味并赋予其益生功能。脂类物质对奶酪的风味及保存具有重要影响，不同霉菌对脂肪的分解情况不同，降解产物脂肪酸的差异直接影响奶酪的风味及营养价值[12]。有机杂环化合物在香料界的认可度较高，大多数具有特征香气且阈值极低，奶酪中此类物质的差异可能是造成风味差异的关键[13]。有机硫化合物（Organosulfur compounds）虽然仅占0.289%，但由于气味刺激特殊，其在奶酪中的含量与种类对奶酪风味的影响较大。

将检测到的16841 个共有代谢物离子作为因变量，4 款奶酪作为自变量，于SIMCA 14.1 进行OPLSDA 分析，如图2 所示，不同字母组及颜色的散点代表不同的奶酪样本，可以观察到4 种奶酪样品之间存在显著的分离趋势，可以实现4 款奶酪的有效区分。本次分析中，自变量拟合指数PosR2x 为0.762、NegR2x 为0.823，因变量拟合指数PosR2y 为0.659、NegR2y 为0.661，模型预测指数PosQ2为0.643、NegQ2为0.645，R2与Q2>0.5，证明模型稳定可靠。为避免模型发生过拟合，经过200 次置换检验对模型进行检验以确保模型的有效性。如图3 所示，Q2截距小于零，说明模型不存在过拟合，稳健性良好。这些结果表明，OPLS-DA 清楚地区分了不同的奶酪样本，且组内平行样品无明显偏差。

图2 OPLS-DA 得分图Fig.2 OPLS-DA scores plots

图3 OPLS-DA 置换检验图Fig.3 OPLS-DA permutation test plots

2.2 红曲霉奶酪的代谢产物特征分析

为分析红曲霉奶酪与其他霉菌成熟奶酪（青霉奶酪、白霉奶酪）相比所具备的代谢产物特征，通过红曲霉奶酪BC20 分别与青霉奶酪、白霉奶酪，红曲霉奶酪ZX-99 分别与青霉奶酪、白霉奶酪这4 个比较组的差异倍数（Fold change，FC）、显著性水平（Pvalue，P）对鉴定到的2510 个代谢物进行筛选。各组正、负离子模式下的火山图，如图4 所示，红色散点对应的物质在红曲霉奶酪中显著上调，蓝色散点对应的物质在红曲霉奶酪中显著下调，黑色散点对应的物质在红曲霉奶酪与其他霉菌奶酪中差异不显著或差异倍数在0.5～2 之间，直观地展示了红曲霉奶酪较其他两款霉菌奶酪代谢物质显著变化的情况，并对有定性名称且变量权重值（Variable importance for the projection，VIP）>1 的显著性差异代谢物，选择表达变化上调的TOP5 和下调的TOP5 进行标记，标记物质的详细信息见表1、表2。

表1 红曲霉奶酪中差异代谢物上调信息Table 1 The information of differential metabolites up-regulated in Monascus cheese

图4 不同奶酪比较组的火山图Fig.4 Volcano map of different cheese comparison groups

结合火山图与表1、表2 可知，红曲霉奶酪BC20、红曲霉奶酪ZX-99 分别与青霉奶酪、白霉奶酪的4 个比较组中，代谢物质上调及下调的情况差异较大，这说明实验组所选择的两款红曲霉奶酪各具特色，后续对于两款红曲霉奶酪各自特色的代谢产物进行筛选后，保留下的共同富集代谢产物对于红曲霉奶酪这一品类的初步描述具有较高的准确性。同时，也说明青霉奶酪与白霉奶酪之间的代谢物存在较大差异，对照组的选择对于目标物的筛选具有较好的排除干扰作用。

由 VIPAC、AD、BC、BD>1、FCAC、AD、BC、BD<0.5 或>2、PAC、AD、BC、BD<0.05 对鉴定到的2510 个代谢物进行筛选，得到130 个POS、79 个NEG 代谢物，此为两款红曲霉奶酪与青霉奶酪、白霉奶酪相比所共有的显著差异代谢产物。在此基础上，对筛选所得物质进行二次筛选，筛选条件为：FCAC、AD、BC、BD>2，VIPAB≤1，PAB≥0.05，得到 16 个 POS、7 个 NEG 代谢物，此为两款红曲霉奶酪与青霉奶酪、白霉奶酪相比所共有的显著富集代谢产物（且这23 个代谢物在两款红曲霉奶酪间没有显著差异），可初步判断红曲霉奶酪这一品类代谢产物的共同特征，物质信息如表3 所示。

对表3 中的物质进行信息检索，发现有8 个物质具有一定有益生物活性或药理活性。其中，4 个物质具有抗菌活性，分别是夫西地酸[14]、甘草皂苷h2[15]、苔黑酚[16]以及25-去乙酰基利福喷丁[17]；2 个物质具有抗炎活性，分别是葫芦素e[18]、甘草皂苷h2[15]；2 个物质具有抗氧化活性，分别是葫芦素e[18]、苔黑酚[19]；2 个物质具有抗瘤防癌活性，分别是葫芦素e[20,21]、苔黑酚[22]；3 个物质对心血管疾病的治疗有一定帮助，分别是喹那普利[23]、甲基多巴[24]以及甘草皂苷h2[15]；1 个物质对良性前列腺增生及下尿路症状有治疗作用，为阿夫唑嗪[25]。抗菌及抗氧化物质的富集对于食品的保存具有较大积极作用，抗炎、抗瘤防癌及缓解心血管疾病物质的富集将给食用者带来一定益生效果。

诸多研究表明，红曲霉的代谢产物红曲色素具有抗菌、抗氧化、降血压的作用[26-27]，但其具体活性物质仍未明确，该研究发现的夫西地酸、甘草皂苷h2、苔黑酚、25-去乙酰基利福喷丁、葫芦素e、喹那普利、甲基多巴可能是红曲色素呈现相应活性的关键。此外，一些红曲霉发酵制品（红曲米、红曲醋、红曲薯蓣等）被报道具有抗炎、抗癌、降血糖、降胆固醇的作用[28-29]，该研究发现的葫芦素e、甘草皂苷h2、苔黑酚可能是其他红曲霉发酵制品呈现相应活性的关键。目前，尚未有研究发现青霉奶酪和白霉奶酪具有缓解心血管疾病方面的益生效果，若具有该类益生功效的物质在红曲霉奶酪中达到起效浓度，则缓解心血管疾病是红曲霉奶酪较青霉奶酪、白霉奶酪所独有的益生功能。

除了以上这些具有功能性的有益代谢产物，短肽由于具有更易被人体吸收代谢的优势也受到多方面的关注，而对于表3 所涉及的短肽“酪氨酸-亮氨酸-赖氨酸”，暂无关于生物活性和对风味影响方面的报道。吡嗪类物质通常具有成熟豆豉的风味[30]，而表3 中该类物质的具体风味暂无研究表明，这可能是区分红曲霉奶酪与其他霉菌奶酪风味差异的关键之一。更多红曲霉奶酪共同显著富集代谢产物的具体生物功能或风味特征还有待深入研究。

2.3 KEGG 代谢途径分析

通过红曲霉奶酪与其他霉菌奶酪差异代谢途径的分析，可更好地了解红曲霉对成熟奶酪带来的影响。图5 展示了不同比较组中显著性较高且上调的前20 条差异代谢通路，共有的显著差异代谢通路有10 条，分别为ABC 转运（ABC transporters），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine, aspartate and glutamate metabolism） ， 氨酰-tRNA 生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids），γ-氨基丁酸能突触（GABAergic synapse），甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢（Glycine, serine and threonine metabolism），矿物质吸收（Mineral absorption），mTOR 信号通路（mTOR signaling pathway），蛋白质消化和吸收（Protein digestion and absorption），缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（Valine, leucine and isoleucine biosynthesis）。

其中，在红曲霉奶酪BC20 vs 青霉奶酪、红曲霉奶酪BC20 vs 白霉奶酪、红曲霉奶酪ZX-99 vs 青霉奶酪这3 个比较组中，蛋白质消化和吸收通路的富集程度显著高于其他通路；在红曲霉奶酪ZX-99 vs 白霉奶酪比较组中，蛋白质消化和吸收通路的富集程度显著低于ABC 转运通路并高于其他通路。与蛋白质消化和吸收通路相关的代谢物有异戊酸，DL-色氨酸，赖氨酸，吲哚，丙酸，DL-酪氨酸等。以上举例的6 个代谢物同时为2.2 中分析所得的显著差异代谢产物，其中异戊酸的物质含量在两款红曲霉奶酪中显著减少，丙酸与DL-酪氨酸的物质含量在两款红曲霉奶酪中显著增加。

在10 条红曲霉奶酪共有差异代谢通路中，与氨基酸相关的通路占比较大，所涉及的共同差异代谢产物有高三尖杉酯碱，2-异丙基苹果酸，肌酸，DL-色氨酸，DL-酪氨酸，L-苏氨酸，赖氨酸，丙酮酸，琥珀酸，酮亮氨酸，甜菜碱等。以上举例的11 个代谢物同时为2.2 中分析所得的显著差异代谢产物，其中丙酮酸、酮亮氨酸、甜菜碱的物质含量在两款红曲霉奶酪中显著减少，高三尖杉酯碱、2-异丙基苹果酸、肌酸、DL-酪氨酸、琥珀酸的物质含量在两款红曲霉奶酪中显著增加。

异戊酸具有刺激性和酸败的味道，在浓度极低时则呈现出甜润的果香，丙酮酸具有酸味和醋酸气味，这两个物质在两款红曲霉奶酪中的含量相对较小，可能是红曲霉奶酪较青霉奶酪、白霉奶酪口味更加温和的原因之一。甜菜碱有甜味，可为奶酪增添风味，同时具备抗炎、抗氧化等活性，可为奶酪带来一定益生效果[31]，但其含量在两款红曲霉奶酪中相对较小，后续可尝试通过代谢的定向调控来富集此类物质。丙酸对食品具有防腐保鲜的作用，但具有一定刺激性气味，后续可对红曲霉奶酪中的丙酸进行定量，研究其在奶酪中适宜的浓度范围。琥珀酸具有酸味，阈值为0.039%，有研究表明其对红腐乳的风味特征起重要作用[32]，故琥珀酸可能是红曲霉发酵制品的共有特征物质。

通过KEGG 代谢途径富集分析，由蛋白质消化和吸收通路的富集程度及共有差异代谢通路中氨基酸相关通路的占比可知，蛋白质和氨基酸这两部分对于红曲霉奶酪具有较大的生物学重要性，后续研究可重点关注相关部分所涉及的节点物质，可能是定向调控的关键。

对于红曲霉的功能性代谢产物，较为熟知的有具有降脂功效的莫纳克林K[33]、可降压凝神的γ-氨基丁酸[34]以及可作为着色剂或提供抗菌性的红曲色素[26]。除此之外，在KEGG 代谢途径所涉及的产物中又发现了一些新的显著富集功能性代谢产物，例如高三尖杉酯碱、2-异丙基苹果酸、肌酸。高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）是一种可从三尖杉属植物中提取获得的生物碱，被广泛应用于血液病的治疗，且具有一定抗肿瘤活性[35-37]，其物质含量在红曲霉奶酪BC20 中最高，是青霉奶酪中的55 倍、白霉奶酪中的63 倍。2-异丙基苹果酸（2-Isopropylmalic acid，2-IPMA）具有温和的抗菌及抗氧化活性且无细胞毒性，适宜应用于食品防腐剂[38]，其物质含量在红曲霉奶酪BC20 中最高，是青霉奶酪中的84 倍、白霉奶酪中的193 倍。肌酸（Creatine，Cr）主要存在于动物源食物中，是一种功能性膳食补充剂，具有改善机体能量代谢、促进肌细胞发育、抗氧化等生物学功能[39-40]，在红曲霉奶酪中的物质含量是其他两款奶酪的2～4 倍。通过代谢途径与代谢产物的结合，有望通过定向代谢调控，进行红曲霉生物功能乳制品的研发，使产品更具益生功能。

3 结论

两款红曲霉奶酪、一款青霉奶酪、一款白霉奶酪之间的差异代谢产物中共鉴定出2510 种代谢物，有23 个代谢物在红曲霉奶酪BC20 与红曲霉奶酪ZX-99 中共同富集且在红曲霉奶酪组间无显著差异，初步判断这些物质为红曲霉奶酪代谢产物的特征。同时，有研究表明这23 个代谢物中，有8 个物质具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗瘤防癌、缓解心血管疾病等生物或药理活性，分别是夫西地酸、甘草皂苷h2、阿夫唑嗪、苔黑酚、25-去乙酰基利福喷丁、葫芦素e、喹那普利、甲基多巴，为红曲霉奶酪带来了一定益生功能。通过KEGG 代谢通路分析，确定了10 条差异代谢通路，包括ABC 转运、蛋白质消化和吸收、氨基酸类代谢通路等。一些与这些代谢途径相关的特征代谢产物具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等功效，例如高三尖杉酯碱、2-异丙基苹果酸、肌酸，对于生物功能乳制品的开发极具参考价值。

目前通过代谢组学系统全面的表征了红曲霉奶酪与其他霉菌成熟奶酪在代谢产物方面的差异，为红曲霉奶酪的定义、目标代谢方向的调控以及有益代谢物质的富集提供了一定依据。但由于非靶向代谢组学在检测过程中并未对代谢产物定量，故暂不明确红曲霉奶酪中富集的有益物质是否达到起效浓度，后续可研究该类物质在红曲霉奶酪中的具体含量以及经消化后对人体的影响。在分析过程中，部分代谢物质的具体功能暂无相关文献表明，后续可尝试研究其具体功能及调控方法。目前，由于同时具备食用安全性、奶酪成熟能力以及风味优势的红曲霉菌株较为稀缺，故该研究只选用了两株红曲霉所制成的奶酪进行分析。但是，红曲霉菌株的种类非常丰富，不同红曲霉菌株之间存在一定差异。因此，后续可寻找更多适宜用于奶酪成熟的风味优势红曲霉菌株，并对更多红曲霉奶酪的代谢产物进行分析，以便更全面、准确地认识其代谢产物特征。