基于模糊数学感官评价的发酵河鲀鱼肠工艺优化

刘 玉，陈晓婷，吴靖娜，刘智禹*，周常义

(1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发分中心，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；3.厦门医学院，福建 厦门 361023)

暗纹东方鲀 (Takifugu obscurus)为四齿鲀科(Tetraodontidae)东方鲀属的鱼类，主要分布在我国近海 (东海、黄海和渤海)和长江中下游，属于海淡水洄游鱼类。其肝脏、卵巢和血液均有剧毒，皮和精巢有弱毒，鱼肉无毒[1]。有研究分析了3 个地区的3 种不同养殖模式下红鳍东方鲀(T.rubripes)的肌肉营养组成、风味物质含量等特性，结果显示3 种养殖模式下，其水分、粗蛋白和粗脂肪之间都不存在显著差异，同时肌肉中检测到18种常见氨基酸，氨基酸总量平均达肌肉湿样的(15.65%±0.95%)，或占肌肉比重79.13 g/100.00 g～83.19 g/100.00 g (干重)[2]。养殖雄性暗纹东方鲀肌肉中多不饱和脂肪酸 (PUFA)含量为0.52%，DHA 含量为0.16%，氨基酸总量为80.08 g/100.00 g(干重)，并且鱼肉和精巢中富含Se，其氨基酸种类齐全，必需氨基酸占总氨基酸的比例为44.13%～49.80%，属于食源性优质蛋白[3]。

以暗纹东方鲀为代表，其体内含有优质蛋白质、脂肪，同时富含鱼油 (DHA、EPA)和人体必需的8 种氨基酸及多种微量元素，营养丰富，食用价值高[4]，因此河鲀深受广大消费者的喜爱，是一类经济价值高、开发潜力巨大的水产珍品[5-6]。但是河鲀肉不易贮藏，在4 °C条件下冷藏，仅有约4 d 的货架期，因此延长河鲀的货架期成为亟待解决的问题[7]。

近年来，将微生物用于鱼肉制品的加工受到国内外众多学者的关注。随着时代的发展，缓慢不可控的传统发酵方式已经无法满足生产消费需求，人为添加发酵剂，控制发酵条件加快发酵食品的成熟是现代发酵制品生产的普遍方式[8-9]。微生物发酵通常会混合使用乳酸菌、微球菌和酵母菌等多种益生菌，微球菌科(Micrococcaceae)中的葡萄球菌属(Staphylococcus)常见于发酵食品中。葡萄球菌在与乳酸菌的生存竞争中，不会因为pH 的降低而受到影响，在发酵期和成熟期的最初主要依靠乳酸菌的作用，最终发酵制品的风味、口感和颜色等感官品质还依靠葡萄球菌和酵母菌的共同作用，使用混合发酵剂不仅可以抑制腐败微生物的生长繁殖，还能降低硝酸盐、亚硝酸盐、生物胺、过氧化氢等不良发酵代谢产物的含量[10]，从而得到色泽稳定、风味独特、口感优良、营养丰富的肉类发酵制品。

在生产工作与科学实验中，人们经常会遇到模糊概念或现象，随着科学技术的发展，各学科领域对于这些模糊概念有关的实际问题都需要给出定量的分析，模糊数学就是研究和处理具有不确定性和模糊性的量的变化规律的一种数学方法[11]。食品感官评价是对食品品质综合质量判断的重要实验方法，但是感官评价主要使用等级评分，同时需要评价者通过多种感知渠道对食品的综合属性进行评定，易受评价者主观想法的影响，因此使用模糊数学综合评价法能得到更为客观而准确的结果[12]。

本研究以暗纹东方鲀为原料，用戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、木糖葡萄球菌 (Staphylococcus xylosus)作为发酵剂，利用模糊数学综合评价法确定辅料配方，通过正交试验设计对发酵条件进行优化，旨在为开发发酵河鲀鱼肠提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

暗纹东方鲀取自福建省鲀之鲜水产有限公司。冻干菌种 (CICC 22227 戊糖片球菌、CICC 21803植物乳杆菌、CICC 21445 木糖葡萄球菌)来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。马铃薯淀粉，安徽山河药用辅料股份有限公司。食用盐，福建省盐业集团有限公司。葡萄糖，山东祥瑞药业有限公司。蔗糖，厦门市新兴贸易有限公司。MRS肉汤培养基、MRS 琼脂培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

BSAB201 电子天平 (德国赛多利斯)。BS124S电子分析天平 (德国赛多利斯)。VT-840K-U 洁净工作台 (苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)。GI54DWS 高压灭菌器 (美国ZEALWAY)。5810R高速冷冻离心机 (德国eppendorf)。SHKE6000-8CE低温可叠放摇床 (美国Thermo Scientific)。BSP-100 生化培养箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。BGZ-140 电热鼓风干燥箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。SZ-18 小型高速斩拌机 (广州旭众食品机械有限公司)。HWS-28 电热恒温水浴锅 (上海一恒科学仪器有限公司)。IMS-25 雪花制冰机 (常熟市雪科电器有限公司)。DW-86L388A立式超低温保存箱 (青岛海尔特种电器有限公司)。BCD-569W 冷藏冷冻冰箱 (德国西门子)。FE28 pH 计 (瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 发酵河鲀鱼肠制备

以戊糖片球菌、植物乳杆菌、木糖葡萄球菌为发酵剂，按照购买菌种机构提供的说明书，将冻干粉末用液体培养基溶解后，在平板内划线培养，再将单个菌落接种到液体培养基中扩大培养12 h。培养结束后，菌落计数调整菌悬液浓度至107CFU/mL，按照菌悬液体积比1∶1∶1 混合菌悬液后，放入4 °C 冰箱待用[13]。按鱼肉质量分数添加马铃薯淀粉10%、蔗糖4%、葡萄糖3%、食用盐2%、菌悬液3%，为发酵鱼肠基础配方。

暗纹东方鲀鲜活宰杀后采肉清洗，4 °C 下沥干水分，低温条件下添加辅料与发酵剂，斩拌3 min 使其混合均匀，灌制鱼肠，放入生化培养箱中35 °C 发酵8 h。发酵结束后采用二段式加热的方式对鱼肠进行加热，先低温45 °C 加热1 h，再高温95 °C 加热30 min，然后用冰水迅速冷却，放入4 °C 平衡12 h 备用[14-15]。本研究实验过程中操作人员严格遵守集美大学动物实验伦理规范，并按照国家质量监督检验检疫总局制定的实验动物福利伦理审查标准执行。

1.4 采用模糊数学综合评价法优化辅料添加量

辅料添加量单因素实验条件设置 葡萄糖添加量组加入不同质量比(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)的葡萄糖；食用盐添加量组加入不同质量比(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)的食用盐；马铃薯淀粉添加量组加入不同质量比(6%、8%、10%、12%)的马铃薯淀粉，其余辅料添加量不变，总共设置14 个辅料添加量优化样品。

模糊数学模型建立 请10 位经过专业培训，具有食品感官评价经验的专业人员对发酵后的样品进行感官评价，感官评价标准见表1。利用模糊数学综合评价法得出葡萄糖、食用盐和马铃薯淀粉的最佳添加量。

表1 感官评价表Tab.1 Sensory evaluation rules

根据感官评价标准设定感官指标评定论域U={口感(u1)，风味(u2)，色泽(u3)，组织状态(u4)}；感官评语评定论域V={优，良，中，一般，差}。根据发酵鱼肠中口感、风味、色泽与组织状态在整体感官质量中所占据的重要性，可以将其权重域设定为A={0.20，0.40，0.20，0.20}。

Y是U到V上的一个模糊映射集，综合评判的结果集Y就是由模糊关系矩阵R与各指标因素权重域A计算而得，具体公式可表达为Y=R·A[16]。

1.5 采用正交试验设计法对发酵条件优化

采用单因素轮换实验依次优化发酵剂接种量(1%、2%、3%、4%、5%)；发酵时间 (8、12、16、20、24、28、32、36、40、44 和48 h)；发酵温度(25、35、45 和55 °C)。

请10 位经过专业培训，具有食品感官评价经验的专业人员对发酵后的鱼肠进行感官评价，感官评价细则见表1。在单因素实验的基础上，以感官评分为评价指标，采用L9(34)正交表 (表2)，利用正交试验设计法得出发酵剂接种量、发酵时间、发酵温度的最优发酵条件组合[17]。

表2 正交因素水平设计Tab.2 Orthogonal of factors and levels design

1.6 数据分析

使用正交设计助手IIV 3.1 以及GraphPad prism 8.02 软件进行数据分析。

2 结果

2.1 模糊数学模型建立

汇总整理辅料添加量感官评价实验结果，得出模糊关系综合评判集 (表3)。根据“采用模糊数学综合评价法优化辅料添加量”中的方法设置葡萄糖、食用盐和马铃薯淀粉这3 种辅料的14 个不同添加量的样品(表4)。

表3 模糊关系综合评判集Tab.3 Fuzzy relational comprehensive evaluation set

表4 感官评价结果Tab.4 Results of the sensory evaluation

样品1 的口感官评分：选择优的2 人，选择良的1 人，选择中的2 人，选择一般的5 人，选择差的0 人。将上述评价人数除以总参与人数10 人，得到模糊矩阵R1第1 行，同理，样品1 风味、色泽、组织状态的感官评分分别为模糊矩阵R1第2 行、第3 行、第4 行。由此可得所有样品的模糊矩阵R，即：

模糊矩阵结果与权重因素集通过模糊变换得到模糊综合评价值，以第一组为例：

式中，Y1-1=0.2×0.20+0.5×0.40+0.0×0.20+0.1×0.20=0.26，以此类推可得Y1-2=0.32，Y1-3=0.18，Y1-4=0.22，Y1-5=0.02，由此可得到Y1=(0.26，0.32，0.18，0.22，0.02)，同理：

将感官评价等级设置为优(100 分)、较好(80分)、中等(60 分)、一般(40 分)、差(20 分)，即评价等级集K=(100，80，60，40，20)，将矩阵结果和评价集经过计算得出感官评分(表4)。

根据感官评价结果得出辅料最佳添加量：葡萄糖添加量3%、食用盐添加量2%、马铃薯淀粉添加量10%、感官评价得分分别为78.00、75.20和74.80。

2.2 发酵条件单因素实验感官评价结果

对发酵条件单因素实验样品进行感官评价，同时，发酵36 h 后鱼肠变质，因此发酵时间感官评价实验在36 h 结束。结果见图1，图2，图3，发酵剂接种量感官评分最高为66.40，发酵时间感官评分最高为63.80，发酵温度感官评分最高为64.40。选择每组评分最高的发酵条件参数：发酵菌悬液接种量3%、发酵时间12 h、发酵温度35 ℃，做为正交试验的基础。

图1 发酵鱼肠发酵剂接种量感官评价结果Fig.1 Results of sensory evaluation for incubation amount in fermented pufferfish sausage

图3 发酵鱼肠发酵温度感官评价结果Fig.3 Results of sensory evaluation for the fermentation temperature in fermented pufferfish sausage

2.3 发酵条件正交试验优化

在单因素实验基础上进行正交实验设计，根据表2 设计的因素水平来考察接种量(A)、发酵时间 (B)、发酵温度 (C)这3 个因素对感官评价结果的影响，分别设置3 个水平，为接种量2.5%、3.0%和3.5%，发酵时间10、12 和14 h，发酵温度30、35 和40 °C，以上数据为表5 中括号内数字，根据正交性从全面试验中选择9 个最具代表性的实验组合，以感官评分为考察指标，确定发酵工艺条件。正交试验结果见表5。

表5 发酵鱼肠工艺条件优化正交试验结果Tab.5 Results of orthogonal experiment for fermented pufferfish sausage technology optimization

根据正交试验直观分析结果可以得知，接种量的k1为接种量2.5%的考察指标，即感官评分结果：(66.50+59.60+56.80)/3，同理接种量的k2和k3为接种量3.0%和3.5%的感官评分结果，R值为对应的每列k值的最大值减去最小值，发酵时间与发酵温度的结果以此类推。发酵条件选择由k值决定，最佳发酵工艺条件：接种量3.5%、发酵时间10 h、发酵温度35 ℃。对感官评价结果的影响主次因素由R值大小决定，即发酵时间＞接种量＞发酵温度。

2.4 最佳发酵工艺条件验证

按照最佳发酵条件制作发酵鱼肠，实验组感官评分为79.70 分。对照组发酵温度为0 °C，其余条件与实验组一致，其感官评分为72.50 分。与对照组相比，发酵后的鱼肠口感得到明显改善。

3 讨论

发酵制品中常用的微生物主要有乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌等[18]。根据2010 年我国原卫生部发布的《可用于食品的菌种名单》和新资源食品公告，其中戊糖片球菌、植物乳杆菌、木糖葡萄球菌均为可用于食品加工的微生物，同时木糖葡萄球菌用于肉类生产的时间已超过30 年。因此，本研究采用戊糖片球菌、植物乳杆菌、木糖葡萄球菌作为发酵剂，制备发酵河鲀鱼肠制品。

有研究表明，葡萄球菌能产生硝酸盐还原酶，可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，在pH 值较低的环境下亚硝酸盐被分解成NO，同时产生的过氧化氢酶能够消除乳酸菌代谢所产生的过氧化氢，过氧化氢作为强氧化剂，会对肉类发酵制品的风味产生负面的影响[19]。此外，蛋白酶和脂肪酶对肉类发酵制品后期成熟时呈色、呈味与独特口感的形成有重要影响[20]。也有国外研究人员发现，发酵肉类制品中分离出的凝血酶阴性的葡萄球菌可能是帮助降解硝酸盐和亚硝酸盐的主要菌种[21]。此外，采用包含清酒乳杆菌(L.sakei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)和戊糖乳酸菌(L.pentosus)的混合发酵剂制作香肠，结果显著降低了干发酵香肠中酪胺、尸胺和腐胺的含量[22]。曾雪峰[23]发现，接种了混合菌发酵剂的酸鱼在发酵过程中酪胺、尸胺和腐胺的积累受到显著抑制。因此，使用混合发酵剂不仅可以抑制腐败微生物的生长繁殖，还能降低硝酸盐、亚硝酸盐、生物胺和过氧化氢等不良的发酵代谢产物的含量，增加鱼肉的安全性、保藏性和功能性[24]。

Kopermsub 等[25]使用盐水腌制鱼肉，在添加大米和蒜末后得到泰国的传统发酵鱼制品plaasom。有研究人员采用16S rRNA 高通量测序技术研究鱼露发酵过程中细菌群落演替的规律，结果显示，在发酵6 个月时细菌种数达到最大 (312种)，发酵12 个月时菌群多样性有所下降，菌群间的差异变小，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为整个发酵过程中的主要菌种类型，联合GC-MS 检测其挥发性成分，筛选得到9 种呈香风味化合物[26]。有研究测定了日本传统食物Narezushi 的抗氧化能力和对超氧阴离子自由基的清除能力，鉴定得出5 株乳酸菌能够发酵乳糖，在培养基中生长能清除DPPH 和超氧阴离子，在发酵牛奶时，也表现出同样的协同效应[27]。对鱼露发酵过程中的挥发性风味成分和脂肪酸组分变化进行研究，采用GC-MS 在5 个不同的发酵时间点进行检测，得到了7 大类56 种挥发性化合物，以香气活力值(OVA)为依据筛选出12 种对鱼露风味贡献显著的主体呈香化合物，鱼露中的脂肪酸主要为C15～C26，不饱和脂肪酸(UFA)相对含量高达67.23%[28]。后续研究发酵河鲀鱼肠还可通过选择优良发酵菌种、比较发酵产物对产品风味品质形成的影响等方面开展探讨。

4 结论

本研究以暗纹东方鲀为主要原料，以戊糖片球菌、植物乳杆菌、木糖葡萄球菌为发酵剂，建立了基于模糊数学综合评价法进行感官评价的方法，发酵河鲀鱼肠的最优辅料配方为葡萄糖添加量3%、食用盐添加量2%、马铃薯淀粉添加量10% (均为质量分数)，最佳发酵条件为接种量3.5%、发酵时间10 h、发酵温度35 °C，感官评分为79.70 分。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）