脊尾白虾“僵尸病”的初探

赵 然，史文军，王李宝，黎 慧，于志君，胡润豪，吴旭干，沈 辉，乔 毅，成 婕，蒋 葛，万夕和*

(1.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007)

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)又名小白虾、五须虾，属于甲壳亚门(Crustacea)十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)，由于其肉质细嫩、味道鲜美，生长速率快、繁殖能力强、适应性广且具有较高的经济价值[1]，在江苏沿海地区得到了快速广泛的推广，是我国特有的经济虾类之一[2]。随着养殖规模的逐年扩大，脊尾白虾的病害问题也愈加严重，近年来不断有脊尾白虾受不同病原危害造成养殖户经济损失的报道，如偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus，CMNV)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、血卵涡鞭虫(Hematodinuimsp.)、白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)等，其中以白斑综合征为甚，常暴发于8 月和9 月，患病池塘脊尾白虾死亡率可达60%以上[3-9]。

自2018 年冬季以来，江苏沿海地区池塘养殖的脊尾白虾开始出现一种不明原因的疾病，病虾表现为僵尸状，当地养殖户称之为“僵尸病”，患病脊尾白虾体色泛红，肌肉浑浊，反应迟钝，摄食减少，头胸甲下蓄积大量乳白色液体，病虾离水后较快死亡，给养殖业造成较大的经济损失。为更好地对该病进行防控，实验对患病脊尾白虾进行了流行病学及病理学研究，同时开展了病原的分离、回感及鉴定，确认了该病的病原。相关研究结果为江苏沿海脊尾白虾“僵尸病”的防治提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

病原、病理学研究用样品为2021 年3 月于江苏省启东黄海滩涂开发有限公司养殖区采集具有典型“僵尸病”病症的濒死患病脊尾白虾，对病虾采集后低温冷藏保存，分别用于病原分离、组织切片和透射电镜观察。实验过程中操作人员严格遵守实验动物伦理规范，并按照上海海洋大学动物伦理委员会制定的规章制度执行。

1.2 流行病学调查

2018—2021 每年11 月—次年5 月，于江苏沿海脊尾白虾主养区启东、通州湾、如东、东台、大丰和滨海等地实地走访，调研脊尾白虾“僵尸病”发病特征、发病时间和发病率等情况。

1.3 病理学研究

组织病理学 取经10%甲醛溶液固定的正常与患病脊尾白虾肝胰腺、鳃和肌肉组织样品，经常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红(H.E)染色，光学显微镜观察组织病理变化情况。

细胞病理学 取经2.5%电镜用戊二醛固定的患病脊尾白虾肝胰腺、鳃和肌肉组织样品，磷酸漂洗液漂洗3 次，1%锇酸4 °C 固定2 h；ddH2O 漂洗3 次后乙醇梯度脱水，脱水浓度梯度为30%、50%、70%、80%、95%、100% (2 次)，每次 15 min，环氧丙烷过渡，812 树脂梯度渗透后包埋，60 °C 聚合，包埋块用Leica UC7 型超薄切片机进行半薄定位及超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色切片，用透射电镜观察组织超微结构。

1.4 病原体分离、回感及鉴定实验

病原菌分离与纯化 用75%乙醇擦拭典型患病脊尾白虾体表，无菌操作下取其血淋巴液接种于LB 培养基27 °C 培养48 h 后，平板上生长出均一菌落，显微镜下表现为酵母形态。经划线纯化并接种PDA 平板再次纯培养，用PDA 液体培养基27 °C 振荡培养，收集菌液与60%甘油，按体积比为3∶1 的比例混合，-80 °C 保存备用。

人工回感实验 健康脊尾白虾取自江苏省海洋水产研究所如东海水虾类良种基地，经检测无病原。随机挑选1 000 尾规格相近，平均体长(5.5±0.5) cm，平均体重(2.8±0.6) g，健康、活力好的个体于室内水泥池暂养。暂养用水为经过滤、消毒沉降1 周的自然海水，盐度25、水温(18.0±0.5) °C。每天换水1/3，投喂适量商品配合饲料。取暂养1 周的健康脊尾白虾进行回感实验，实验采用注射法。将分离纯化后的菌株于PDA 液体培养基27 °C 培养36 h，混匀后，取5 mL 菌液于已灭菌的离心管中，2 000 r/min、4 °C、离心3 min后去上清液，然后加等体积灭菌生理盐水漂洗，相同条件下离心，去上清液，重复漂洗3 次后获得注射用原菌液，4 °C 保存备用。用灭菌生理盐水将原菌液分别稀释4、8 和16 倍后进行注射，浓度分别为1.29×109、6.46×108和3.23×108CFU/mL，注射剂量为20 μL/尾，每组200 尾虾；对照组注射等量灭菌生理盐水。注射后各组脊尾白虾分别暂养于500 L PVC 塑料桶中，暂养用水为经过滤、消毒沉降1 周的自然海水，盐度25、水温(18.0±0.5) °C。每天换水1/3，投喂适量的商品配合饲料。回感实验期间，各组所用设备均独立使用，严禁混用，每天观察并记录脊尾白虾的症状与死亡情况，对出现症状明显的患病白虾进行病原分离鉴定。采用改良寇氏法计算分离菌株对脊尾白虾的半致死量：

式中，Xk为死亡率最高组的对数剂量，d为对数组距，ΣP为各组死亡率之和。

病原菌扫描电镜观察 取分离纯化后的病原菌样品置于2.5%戊二醛中固定2～4 h，磷酸漂洗液漂洗3 次，1%锇酸4 °C 固定2 h；双蒸水漂洗3 次后乙醇梯度脱水，脱水浓度梯度为30%、50%、70%、85%、95%、100% (2 次)，每次 15 min，醋酸异戊酯置换，临界点干燥仪干燥及离子溅射仪镀膜后，样品置于扫描电镜台上，转移进入样品舱，HITACHI Regulus 8100 型扫描电镜拍照。

病原菌分子生物学鉴定 离心收集上述分离纯化后的菌株，用酵母DNA 抽提试剂盒(Solarbio，中国)提取病菌的总基因组DNA 作为PCR模板。采用SSU 引物进行PCR 扩增，上游引物SSUF: 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′；下游引物SSUR: 5′-TGATCCTCCTGCAGGTTCAC CTAC-3′。30 μL 反应体系：上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，PCR Premix 15.0 μL，ddH2O 补足至30 μL。反应条件：94 °C 预变性10 min；94 °C变性30 s，59 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min，循环35 次；72 °C 终延伸10 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，预计片段大小约1 700 bp。模板扩增纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将病原菌株18SrRNA基因序列提交至GenBank，并将数据与NCBI 数据库进行对比，选择相似度较高的序列和不同种属的序列，使用MEGA 7.0 软件采用Neighbor-Joining 法构建系统进化树。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

患“僵尸病”脊尾白虾的主要症状 患病脊尾白虾表现出摄食下降或停止摄食、行动缓慢、反应迟钝，离水不久便会死亡。患病脊尾白虾体表泛红，附肢肿大呈白浊状，头胸甲与附肢连结处呈肿胀突出，打开头胸甲发现肝胰腺糜烂，内部有大量乳白色组织渗出液聚集，肌肉出现不同程度的液化，呈不透明的白色，血淋巴液也由正常时的透明色转变为乳白色(图版Ⅰ)。

主要流行病学特点 脊尾白虾“僵尸病”于2018 年冬季开始在启东黄海滩涂开发有限公司养殖区首先出现，呈慢性传播，病情向邻近地区蔓延特点明显，上年发病的池塘下年一般都会复发。周年跟踪调查显示，脊尾白虾“僵尸病”发生的主要流行时间从11 月开始即可被发现，一直到次年5 月，其中高峰期多为2—5 月，此期间海水温度为15～22 °C。从2018 年冬季到2021 年春季，该病的发生越来越严重，特别是在脊尾白虾主产区启东、东台等地；发病率一般为5%～30%，死亡率为3%～10%。该病主要感染个体比较大的脊尾白虾，夏季或早秋无该病的发生。江苏北部沿海脊尾白虾与贝类混养模式中未见发生。相关调查结果见表1。

表1 近3 年江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”发病率及死亡率调查情况Tab.1 Incidence of "zombie disease" and mortality of E.carinicauda in coastal areas of Jiangsu Province in the past three years %

2.2 病理学

图版Ⅰ 患病脊尾白虾症状1.自然患病脊尾白虾和健康脊尾白虾的对比图，病虾附肢肿大呈白浊状(→)；2.肝胰腺糜烂(→)；3.头胸甲下蓄积大量乳白色组织渗出液(→)；4.剪断尾柄可见乳白色血淋巴流出(→)。图中左边均为患病脊尾白虾，右边为健康脊尾白虾。Plate Ⅰ Symptoms of diseased E.carinicauda1.comparison of naturally diseased and healthy E.carinicauda,the appendages of diseased E.carinicauda were swollen,white and cloudy;2.the hepatopancreas was erosive (→);3.a large amount of milky tissue exudate accumulates under carapace (→);4.milky haemolymph was seen when the tail handle was cut off (→).The diseased E.carinicauda on the left and healthy E.carinicauda on the right.

组织切片观察 脊尾白虾鳃由鳃丝和鳃轴组成，健康脊尾白虾的组织切片结果显示，肌肉中肌纤维呈弯曲状紧密排列，肌束间隙较小；肝胰腺小管形状圆润，排列紧密，管腔横截面呈不规则多角形，各小管之间存在结缔组织，功能性细胞均清晰可见。

患病脊尾白虾的组织切片观察结果显示，病虾的鳃丝较肿大，鳃腔出现空泡变性，部分鳃腔中定殖了大量的酵母，鳃轴中大量细胞破碎，无明显细胞结构；肌纤维排列较为松散，失去原有弯曲排列形态，肌束间隙变大；肝胰腺小管出现空泡化，基膜破裂，管腔体积变大，各小管之间排列松散，并发现大量定殖的菌体(图版Ⅱ)。

透射电镜观察 组织透射电镜结果显示，在患病脊尾白虾鳃丝基膜内有酵母的存在，大小形态均与致病菌扫描电镜结果一致；在肌肉中细胞核染色质呈半月状聚集在核膜附近，形成细胞凋亡的特征，肌浆网呈囊泡化扩张，肌丝结构紊乱，部分肌丝溶解断裂。在肝胰腺中，肝小管基膜外存在大量酵母菌，这与组织病理学结果一致，还发现肝胰腺分泌细胞中线粒体肿胀空泡化，残存线粒体腔，其中粗面内质网也表现出囊泡化扩张(图版Ⅲ)。

2.3 病原学研究结果

病原菌分离 在LB 培养基上，从患病脊尾白虾血淋巴中分离得到了一株优势菌，优势度大于95%，在PDA 培养基上对该菌进行纯化培养，生长表现良好，命名为MQ2101。27 °C 条件下培养48 h 后能形成直径为1～3 mm 的米黄色隆起菌落，边缘整齐(图1)。

图1 PDA 培养基上菌株MQ2101 的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain MQ2101 on PDA plate

人工回感实验 实验组中3 组均在感染第1 天出现死亡，1/4 原菌液组第5 天全部死亡，7 d后各组存活率分别为0%、5%和11.5%。对照组在7 d 内均未死亡，存活率为100% (图2)。人工回感后的脊尾白虾表现出与自然患病白虾相同的症状(图版Ⅳ)，且从回感染后脊尾白虾中也分离出了一株优势菌，与菌株MQ2101 的菌落形态、生长特性完全一致，表明分离得到的菌株MQ2101为脊尾白虾“僵尸病”病原菌，且对脊尾白虾具有较强的致病性。

图2 菌株MQ2101 人工回感实验结果Fig.2 Artificial infection results of the strain MQ2101

图版Ⅱ 患“僵尸病”脊尾白虾组织病理学观察1.健康脊尾白虾鳃组织切片；2.患病脊尾白虾鳃组织切片，鳃腔出现空泡化(→)，定殖在鳃丝中的菌体(〇)；3.健康脊尾白虾肌肉切片；4.患病脊尾白虾肌肉组织切片，肌纤维排列较为松散，呈直线状排列(〇)；5.健康脊尾白虾肝胰腺切片；6.患病脊尾白虾肝胰腺切片，肝胰腺中肝胰腺小管出现空泡化(→)，管腔体积变大(▲)，发现大量定殖的菌体(〇)。Plate Ⅱ Histopathological observation of diseased E.carinicauda1.pathohistological observation of gill from healthy E.carinicauda;2.pathohistological observation of gill from diseased E.carinicauda.Vacuolization appeared in the gill cavity (→),and the bacteria colonized in gill filament (〇);3.pathohistological observation of muscle from healthy E.carinicauda;4.pathohistological observation of muscle from diseased E.carinicauda.The muscle fibers arranged loosely and arranged in a straight line (〇);5.pathohistological observation of hepatopancrea from healthy E.carinicauda;6.pathohistological observation of hepatopancrea from diseased E.carinicauda,the hepatopancrea tubules in the hepatopancreas became vacuolated (→),the lumen volume became larger (▲),a large number of colonized bacteria were found (〇).

图版Ⅲ 患“僵尸病”脊尾白虾组织透射电镜观察1，2.鳃中鳃丝基膜内部存在菌体(→)；3.肌细胞细胞核中染色质呈半月状聚集在核膜附近(→)，肌浆网呈囊泡化扩张(▲)；4.肌丝结构紊乱，部分肌丝溶解断裂(〇)；5.肝小管基膜外聚集了大量菌体，部分正在进行出芽繁殖(→)；6.肝胰腺分泌细胞中线粒体空泡化，残存线粒体腔(→)，内质网呈囊泡化扩张(〇)。Plate Ⅲ Transmission electron microscopic observation on the tissue of diseased E.carinicauda1 and 2.there were bacteria in the basement membrane in the gill filament(→);3.the chromatin in the nucleu of the muscle cell was gathered around the nuclear membrane in a semilunar shape (→),the sarcoplasmic reticulum was vesicled and expanded (▲);4.myofilament structure was disordered,and some myofilaments were dissolved and broken (〇);5.a large number of bacteria accumulated outside the basement membrane of the liver tubule,and some were undergoing budding reproduction(→);6.mitochondria in secretory cell of the hepatopancrea were vacuolated (→),and the endoplasmic reticulum were vesicularized and expanded (〇).

根据人工回感实验结果，采用改良寇氏法初步计算脊尾白虾在注射菌株MQ2101 后3 d 时的LD50=1.39×107CFU/尾。

扫描电镜观察 菌株MQ2101 的扫描电镜结果发现，菌体呈椭圆形，繁殖方式为出芽繁殖，在部分菌体表面发现多重出芽留下的芽痕，表现出酵母的形态。从视野中随机选取10 个菌体测量大小，结果显示，单个菌体长度为(1.53～2.88) μm，平均长度为(1.96±0.43) μm，宽度为(0.9～1.44) μm，平均宽度为(1.23±0.17) μm (图版Ⅴ)。

病原菌分子生物学鉴定 通过SSU 引物对MQ2101 菌株进行特异性扩增，获得的目的片段长度为1 703 bp。将基因序列提交至GenBank，登录号为MW876247.1。对目的序列进行BLASTN比对，结果显示菌株MQ2101 与二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)一致性高达99.82%。系统进化树结果显示，MQ2101 菌株与二尖梅奇酵母自然聚为一支，亲缘关系较近(图3)，结合该菌体的形态及其大小特点，判定菌株MQ2101 为二尖梅奇酵母。

图版Ⅴ 菌株MQ2101 扫描电镜观察1.正在进行出芽繁殖的酵母(→)，出芽繁殖后留在酵母表面突出的芽痕(▲)；2.测量菌体的长度、宽度。Plate Ⅴ Scanning electron microscope photograph of strain MQ21011.yeast undergoing budding reproduction (→),the bud scar left on the surface of the yeast after budding reproduction (▲);2.measuring the length and width of the bacteria.

图版Ⅳ 自然感染与人工回感的脊尾白虾1.自然发病(左)与健康(右)脊尾白虾；2.人工回感组(左)与对照组(右)的脊尾白虾。Plate Ⅳ E.carinicauda of natural infection and artificial re-pathogenic1.naturally infected (left) and healthy E.carinicauda (right);2.E.carinicauda of artificial infection group (left) and control group (right).

3 讨论

脊尾白虾“僵尸病”是近几年来在江苏沿海盛行的一种疾病，发病季节主要集中在冬春之交。患病脊尾白虾主要表现出体色发红、反应迟钝、摄食下降，打开头胸甲能发现有大量乳白色液体蓄积。这种症状与2008 年许文军等[10]在浙江地区发现的患“白浊病”脊尾白虾较为相似，患“白浊病”脊尾白虾游动缓慢，体色发白，打开头胸甲可以发现肝胰腺糜烂，血淋巴液呈浊白色，其病原经鉴定为血卵涡鞭虫(Hematodiniumsp.)，是一种寄生在海水甲壳类中的腰鞭虫，能大量寄生于甲壳类动物的血腔、肌肉和肝胰腺中[11]。但由血卵涡鞭虫引起的脊尾白虾“白浊病”主要暴发于夏季高温季节，冬季几乎检测不到发病，因此，江苏沿海地区脊尾白虾“僵尸病”与浙江脊尾白虾的白浊病流行病学特点有明显差异。本研究从患病脊尾白虾血淋巴中分离纯化出菌株MQ2101，经回感实验确定了其为脊尾白虾“僵尸病”的病原菌，结合形态学观察和18SrRNA序列扩增及系统发育分析鉴定其为二尖梅奇酵母，这是首次发现二尖梅奇酵母在海水脊尾白虾养殖中具有致病性的报道。

酵母是一种单细胞真核微生物，属兼性厌氧菌[12]。一些有益酵母菌在水产养殖中也常被当作饲料添加剂使用[13-14]，而有关水产动物酵母菌致病的案例也有研究报道。目前已知的水产动物致病酵母有葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)[15]、莫格球拟酵母(Torulopsis mogii)[16]、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)[17]等。葡萄牙假丝酵母可以侵染三疣梭子蟹使其患乳化病，病蟹蟹体消瘦，各组织乳化严重，发病死亡率可达40%。莫格球拟酵母感染罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)主要暴发于亲虾越冬时，病虾步足发红、肝胰腺糜烂，死亡率可达90%。汉逊德巴利酵母感染罗氏沼虾发生于12 月—次年2 月，病虾体色泛黄，全身肌肉和血淋巴呈白浊状。本研究所分离出的致病酵母为二尖梅奇酵母，是梅奇酵母属的一种，与其同属的美极梅奇酵母(M.pulcherrima)有较强的生物拮抗功能，能够抑制芒果炭疽病的发生[18]，梅奇酵母XY201 (M.zizyphicola)则常被用来抑制冬枣采后的病原真菌[19]。关于二尖梅奇酵母作为病原菌的案例也有报道，2003 年在台湾省就有报道二尖梅奇酵母与屎肠球菌(Enterococcus faecium)混合感染罗氏沼虾[20]，发病时间集中在10 月—次年3 月，最高死亡率达到48%，平均死亡率为25%，病虾表现为食欲不振，体色呈黄褐色，肝胰腺肿大，肌肉浑浊，血淋巴呈乳白色，在肌肉组织中还发现了大小不同的淡黄色斑点。同年又有报道二尖梅奇酵母作为单独致病菌致使大鳞钩吻鲑(Oncorhynchus tshawytscha)患病死亡[21]，主要是由于捕食感染二尖梅奇酵母的成年卤虫而患病，死亡率达到34%，在病鱼内脏中发现大量白色黏连与肿块，内脏与腹腔有大量酵母细胞聚集。2020 年4 月，辽宁省发生中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)患“牛奶病”[22-23]，总体发病率达30%，病蟹活力较差，步足发白易脱落，打开头胸甲可见明显白色牛奶状液体，经鉴定该病病原也为二尖梅奇酵母。结合此次研究可以发现，二尖梅奇酵母感染甲壳类动物多发于低温季节(10 月—次年5 月)，这是目前已报道的二尖梅奇酵母感染性疾病的共同特点。

有关脊尾白虾中二尖梅奇酵母的的致病机制和其在养殖环境中的感染传播途径及具体的防治措施都尚不明确，有待进一步研究。Chen 等[24]提出酵母是在池塘水或沉积物中通过与虾口或鳃的接触而进入虾体内，被宿主血淋巴吞噬并包裹在膜状液泡内，在有限的复制条件下保持存活，当水温降低时宿主对酵母的易感性提高，酵母就在血淋巴中快速繁殖，最终溶解并大量释放酵母细胞。在虾血淋巴中发现的非常高浓度的酵母细胞也证实了这一点，低水温下虾体对酵母的易感性也解释了为何白虾在冬季才开始大规模暴发“僵尸病”。Moore 等[21]认为大鳞钩吻鲑是通过摄食感染二尖梅奇酵母的成年卤虫而患病，酵母通过卤虫作为介质进入鱼体肠道内，在肠道内成熟，通过开裂的方式主动释放针状子囊孢子，针尖状的形态赋予了子囊穿透宿主肠内层的能力，这就使得酵母从肠道开始渗透感染，最后蔓延到全身。脊尾白虾出现“僵尸病”典型症状时，已经进入感染后期，增加了该病的治疗难度。建议养殖过程中加强预防意识，贯彻防大于治的原则，选择优质苗种，加强投喂管理，密切关注环境温度，保持养殖水体稳定平衡，实施养殖环境生态调控，另外可以投放一些肉食性鱼类，捕食感染的病虾，切断传播链，实现脊尾白虾的健康养殖。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）