大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

杨西西，池洪树，郑在予，刘晓东，罗潘潘，许斌福，陈秀霞，龚 晖*

(1.福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003；2.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002；3.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

大黄鱼(Larimichthys crocea)是中国养殖产量最高的海水鱼类[1]，随着养殖规模的扩大，大黄鱼病害问题日益突出，已成为制约大黄鱼产业健康发展的主要因素[2]。何爱华等[3]通过电镜从夏季发病的大黄鱼幼鱼中发现了虹彩病毒(Iridovirus)，Chen 等[4]证实1999—2001 年夏季福建省宁德、罗源等地养殖大黄鱼幼鱼暴发性死亡由虹彩病毒感染所致，根据组织病理学、形态学和分子生物学特征分析，确认该病毒属于肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)，并将其命名为大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus,LYCIV)。近年来，养殖大黄鱼中常有肿大细胞病毒检出[5-6]，但受限于无敏感细胞系，研究无法深入开展，开展的研究主要集中于病毒检测方法的建立和部分功能基因的分析[7-10]。已有团队建立了对ISKNV 型和RSIV 型肿大细胞病毒高度敏感的鳜(Siniperca chuatsi)仔鱼细胞系(mandarin fish fry cell line-1，MFF-1)，基于MFF-细胞可实现ISKNV 型和RSIV型肿大细胞病毒持续、稳定地传代[11-15]。本研究利用MFF-1 细胞系分离培养大黄鱼肿大细胞病毒，对病毒的主要衣壳蛋白基因(major capsid protein，mcp)进行比较分析，以期为大黄鱼肿大细胞病毒病的研究和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

病料 2018—2020 年间所采集，用国家标准GB/T 36191—2018[16]中的1F/R 引物PCR 检测呈阳性的大黄鱼肝脏、脾脏、肾脏等内脏组织，存于-80 °C。(表1)

表1 实验所用的大黄鱼病料Tab.1 Pathologicalspecimens of L.crocea used in the experiment

细胞系 鳜仔鱼细胞系MFF-1。

引物 根据NCBI 上的登录的LYCIV 的mcp(GenBank: AY779031.1)，利用Primer premier 5.0 软件设计扩增全长mcp的引物，上游引物mcpF：ATGTCTGCGATCTCAGGTGC，下游引物mcpR：TTACAGGATAGGGAAGCCTGC，预期扩增片段大小为1 362 bp。

实验试剂 高糖DMEM 培养基、胎牛血清(FBS)、含EDTA 和酚红的胰酶、青霉素和链霉素双抗(Gibco)，血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]。病毒基因组DNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒(Omega Bio-Tek)、2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、琼脂糖粉末、50×TAE 琼脂糖电泳缓冲液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。DL2000 DNA Marker、pMD-19T 载体克隆试 剂 盒、TB Green®Premix ExTaq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，日本)。Triton X-100 (Sigma-Aldrich，美国)。组织固定液：2.5%戊二醛(Sigma-Aldrich，美国)，取25%戊二醛10 mL，0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4) 50 mL，ddH2O 定容至100 mL，4 °C 保存。

1.2 细胞培养

MFF-1 细胞用DMEM 培养基(含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素)于25 cm2细胞瓶中培养，培养条件为5% CO2，27 °C，饱和湿度。0.25%胰酶消化、传代。

1.3 病毒分离、接种与传代

分别将冻存于-80 °C，采自福鼎和宁德沙澳的大黄鱼幼鱼病料(FD201807 和SA201808)肾脏组织装入1.5 mL 离心管中，加入适量的0.1 mol/L PBS (pH 7.4)，在冰浴条件下研磨成浆。4 °C，4 602 ×g离心10 min，取上清液经0.22 μm 滤膜过滤，取500 μL 滤过液加入已弃去培养液的单层MFF-1 细胞中，静置1 h，加入5 mL维持液(含2% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM 培养液)继续培养，每12 小时观察1 次，若7 d 内无病变，细胞与培养液一并收集，冻融3 次后，冻融液于4 °C，2 348 ×g离心10 min，收集上清液，与维持液以1∶10 的比例感染单层MFF-1 细胞继续传代，每7 天盲传1 次，直至出现细胞病变(cytopathic effects，CPE)，80%细胞出现CPE时将细胞与培养液一并收集，按以上方法继续传代。

1.4 电镜观察

收集病毒感染细胞，弃培养液，0.25%胰酶消化，吹洗一下细胞，2 348×g离心5 min，弃上清液，加入1 mL 组织固定液重悬沉淀，再次2 348 ×g离心5 min，弃上清液，补充1 mL 组织固定液，4 °C 保存2 d 后，委托中山大学生命科学学院电镜室按董传甫[12]的方法进行漂洗、脱水、包埋、超薄切片、醋酸铀-柠檬酸铅双染色，最后通过JEM-1400 透射电镜观察。

1.5 病毒全长mcp 的克隆、测序与分析

按病毒基因组DNA 提取试剂盒产品说明书分别提取FD201807 和SA201808 组织匀浆液、15代次的病毒感染细胞冻融液，以及其他15 个大黄鱼病样组织匀浆液总DNA 作为模板。以全长mcp引物进行PCR 扩增，PCR 反应体系：2×TaqMaster Mix (Dye Plus) 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 模板 2 μL，补充ddH2O 至50 μL。PCR 反应程序：95 °C 变性5 s；94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min 20 s，共32 个循环；72 °C延伸5 min。

凝胶电泳后，按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因，连接pMD19-T 载体，转化感受态细胞，用含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 平板筛选阳性克隆，随机挑取3 个阳性克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过NCBI-BLAST 将FD201807株和SA201808 株mcp与GenBank 数据库中肿大细胞病毒mcp进行比对分析，用MEGA 4 软件分别对上述2 株病毒的mcp与GenBank 数据库中肿大细胞病毒以及15 个大黄鱼病料中检出的肿大细胞病毒mcp进行系统发育分析。

2 结果

2.1 病毒对细胞的感染

FD201807 和SA201808 的病料组织匀浆液感染MFF-1，盲传3 代均未出现明显的细胞病变，第4 代感染细胞开始出现病变，病变的主要表现为细胞脱壁、变圆，折光率增强，随着培养时间的延长，脱壁细胞逐渐增多，同时培养液中的颗粒增加，第4 代FD201807 株感染细胞10 d 的细胞病变率达80%，第4 代SA201808 株感染细胞病变率达到80%的时间为12 d。随着代次的增加，病毒感染细胞病变周期逐渐缩短，第15 代FD201807 株感染细胞48 h 时病变率达50%以上，72 h 时细胞病变率达80%以 上。第15 代SA201808 株感染细胞72 h 时部分细胞出现病变，168 h 时细胞病变率近80%。(图版Ⅰ)

2.2 病毒结构特征

电镜观察病毒感染细胞，可见细胞质内存在大量散在的六边形病毒粒子和空壳，直径130～150 nm(图版Ⅱ)。

2.3 病毒全长mcp 基因的克隆、测序结果

用所设计的肿大细胞病毒全长mcp引物对FD201807 和SA201808 的组织匀浆液和15 代病毒的细胞冻融液进行PCR 扩增，均得到了大小约1 300 bp 的单一目的条带(图1)。

图1 FD201807 株和SA201808 株全长mcp 扩增结果M.DL2000 DNA Marker；1.FD201807 组织匀浆液；2.SA201808 组织匀浆液；3.第15 代FD201807 株感染的MFF-1 细胞冻融液；4.第15代SA201808 株感染的MFF-1 细胞冻融液；5.MFF-1 细胞冻融液。Fig.1 Completemcp sequences amplification from isolate FD201807 and SA201808M.DL2000 DNA Marker;1.FD201807 tissue homogenate;2.SA201808 tissue homogenate;3.freeze-thawed MFF-1 cells infected with FD201807,passage 15;4.freeze-thawed MFF-1 cells infected with SA201808,passage 15;5.freeze-thawed MFF-1 cells.

图版Ⅰ 15 代次FD201807 和 SA201808 感染MFF-1 细胞的病变过程1～3.FD201807 株接种后0、48 和72 h；4～6.SA201808 株接种后0、72 和168 h。Plate Ⅰ Cytopathic effects of MFF-1 infected FD201807 and SA201808 at passage151-3.0,48 and 72 h after FD201807 inoculation,respectively;4-6.0,72 and 168 h after SA201808 inoculation,respectively.

图版Ⅱ 病毒感染的MFF-1 细胞电镜照片1.14 代次FD201807 株感染MFF-1 细胞72 h 后的电镜照片(6 000×)；2.第一帧图片的局部放大(15 000×)；3.14 代次SA201808 株感染MFF-1 细胞144 h 后的电镜照片(5 000×)；4.第3 帧图片的局部放大(15 000×)。Plate Ⅱ Electron micrograph of virus-infected MFF-1 cells1.MFF-1 cell infected with FD201807,passage 14,72 h post inoculation (6 000×);2.local zoom of frame 1 (15000×);3.MFF-1 cell infected with SA201808,passage 14,144 h post inoculation (6 000×);4.local zoom of frame 3 (15 000×).

分别对上述目的条带进行胶回收和克隆测序。结果显示FD201807、SA201808 的组织匀浆液和15 代病毒细胞冻融液PCR 扩增产物均为1 362 bp。FD201807 株、SA201808 株与其他相关的肿大细胞病毒分离株比较分析表明，FD201807 株和SA201808 株属于虹彩病毒科(Iridoviridae)肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)的不同病毒分离株。SA201808 株与 LYCIV-Zhoushan (GenBank:MW139932.1)的mcp核酸序列仅有1 个碱基差异，与LYCIV (GenBank: AY779031.1)mcp有5 个碱基差异。FD201807 株与SA201808 的mcp有21 个碱基差异，与花鲈虹彩病毒(Lateolabrax macu-latusiridovirus,LMIV) (GenBank: MH577517.1)mcp存在1 个碱基差异(图2)。

图2 FD201807 株、SA201808 株、LYCIV、LYCIV-Zhoushan 与LMIV-1 706 的 mcp 序列比对灰色区域为5 个序列中相似度为60%的碱基，黑色区域为5 个序列中相似度为80%的碱基。Fig.2 mcp sequences alignment of FD201807,SA201808,LYCIV,LYCIV-Zhoushan and LMIV-1706Grey area.the bases with 60% similarity among the 5 sequences;black area.the bases with 80% similarity among the 5 sequences.

(图2 Fig.2)

与已知的肿大细胞病毒mcp聚类分析结果显示，SA201808 株、FD201807 株归属肿大细胞病毒RSIV 基因型，SA201808 株与FD201807 株有一定的遗传距离(图3)。

图3 肿大细胞病毒mcp 的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on mcp of Megalocytivirus

FD201807 株、SA201808 株与其他15 株大黄鱼肿大细胞病毒mcp的聚类分析结果表明，12 株大黄鱼肿大细胞病毒的mcp序列与SA201808 聚类；另3 株大黄鱼肿大细胞病毒mcp与FD201807以及LMIV(MH577517.1)聚类(图4)。

图4 大黄鱼肿大细胞病毒分离株mcp 系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on mcp gene of the Megalocytivirus isolated from L.crocea

3 讨论

虹彩病毒科可分为α 虹彩病毒亚科(Alphairidovirinae)和β 虹彩病毒亚科(Betairidovirinae)，α 虹彩病毒亚科病毒主要感染硬骨鱼类、两栖类和爬行类等冷血脊椎动物，分为淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞病毒属和蛙病毒属(Ranavirus) 3 个属[17]。肿大细胞病毒属病毒仅感染硬骨鱼类，是鱼类的主要病原[18]，Inouye 等[19]于1990 年在养殖真鲷(Pagrus major)上首次发现真鲷虹彩病毒(red sea bream virus,RSIV)。吴淑勤等[20]于1997 年从鳜上发现一种直径约为150 nm的病毒，He 等[21]对该病毒开展了研究，将该病毒命名为脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)，到目前为止已发现了20余种肿大细胞病毒，感染对象包括鲈形目(Perciformes)、鲽形目 (Pleuronectiformes)、鳕形目(Gadiformes)和鲀形目(Tetraodontiformes)等近百种鱼类[22-24]。适合肿大细胞病毒培养的细胞系较少，在病毒培养过程中常遇到细胞病变缓慢、病毒滴度低或难以稳定传代的问题[23]。Ao 等[25]研究发现，大黄鱼肿大细胞病毒可在BF-2 细胞系上增殖，但未见大黄鱼肿大细胞病毒引起细胞病变的报道，本研究利用MFF-1 细胞对大黄鱼肿大细胞病毒进行了分离培养，经过3 代盲传后，大黄鱼肿大细胞病毒感染的细胞表现出典型的肿大细胞病毒细胞病变特征，经过15 个代次的传代，病毒的感染力并未减弱，CPE 的周期缩短，说明MFF-1 细胞适用于大黄鱼肿大细胞病毒的培养。此外从本研究结果来看，不同来源的大黄鱼肿大细胞病毒对MFF-1 细胞的易感性存在差异，这种差异产生的原因还有待进一步研究。

虹彩病毒的mcp相对保守，因此常被用于虹彩病毒的系统发育分析[26-29]，根据mcp或ATPase可将肿大细胞病毒分成 RSIV、ISKNV 和 TRBIV三个基因型[18]。本研究结果表明，SA201808 株和FD201807 株的mcp与RSIV 基因型病毒的mcp聚类，SA201808 株的mcp与已报道的大黄鱼肿大细胞病毒同源性高，而FD201807 与花鲈虹彩病毒的mcp(GenBank: MH577517.1)高度一致，同时从17 株大黄鱼肿大细胞病毒mcp的聚类分析来看，不同的大黄鱼肿大细胞病毒分布与年份、养殖区域和鱼体大小无直接相关性，同一时间同一养殖区域内可同时存在2 种大黄鱼肿大细胞病毒，推测大黄鱼肿大细胞病毒可能有不同来源且可跨物种感染。大黄鱼肿大细胞病毒的传播途径和进化关系如何，还需做更大范围的调查分析。

本研究实现了大黄鱼肿大细胞病毒的稳定传代培养，为该病毒的致病性研究和疫苗研发提供了条件，通过对大黄鱼肿大细胞病毒的mcp比较分析，为大黄鱼肿大细胞病毒病的流行病学研究和防控提供了参考。

感谢中山大学生命科学学院董传甫课题组为本研究提供细胞系。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）