单环刺螠生物扰动对沉积物-水界面氮磷扩散通量的影响

贾 彦，杜美荣，李文豪，姜娓娓，蔺 凡，姚 亮，吴玉萍，蒋增杰,3*

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东 青岛 266071；3.崂山实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071)

水生生态系统利用能量和物质流动的传递将水层和底栖系统连接起来的过程称为水层-底栖界面耦合[1]。该过程在河口、近岸和浅海水域中有重要作用，而生物扰动在这个过程中影响了沉积物的物理和化学性质[2]。国际上，在20 世纪五六十年代就开展了生物扰动的研究[3]。在国内，在中美浅海生态系统动力学联合研究计划的支持下，建立了生物扰动实验系统(AFS)，开展了沉积物-水界面通量的实验研究，并利用荧光砂示踪法研究了紫彩血蛤(Nutalia olivacea)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)和心形海胆(Echinocardium cordatum)对沉积物的垂直搬运效果[4-6]。有研究表明，底栖动物的生物扰动可以促进不同形态的无机氮在潮滩沉积物-水界面间的迁移转化，尤其对沉积物氮释放有明显的促进作用[7-8]。同时大型底栖动物的摄食或钻沙活动可以影响沉积物的化学特征[9]，如具疣拟海参(Parastichopus parvimensis)和加州拟海参(P.californicus)对沉积物中有机质的含量及其垂直分布影响显著[10-11]，招潮蟹(Uca tangeri)以及多毛类动物中的多齿围沙蚕(Perinereis nuntia)等生物扰动影响了沉积物间隙水溶解氧以及营养盐浓度变化[12-13]，方格星虫(Sipunculus nudus)能够缓解表层沉积物的有机质积累，促进沉积物-水界面的营养盐通量交换[14]。

海水养殖是海洋渔业的重要组成部分，近年来发展迅速[15]。规模化的海水养殖活动常伴随着大量的生物沉积，在加拿大Upper South Cove 贻贝养殖区的生物沉积量是邻近非养殖区的2 倍以上[16]，且随着生物沉积物的聚集，海底沉积物和海水的物理化学特征会发生一系列的改变，进而对生态系统产生负面影响[17]。基于养殖海区的底质条件，通过发挥适养生物的生物扰动作用，促进生物沉积的矿化过程，是解决沉积环境有机质积累问题的有效途径[18]。单环刺螠(Urechis unicinctus)属于螠虫动物门(Echiurioidea)螠纲(Echiurida)无管螠目(Xenopneusta)刺螠科(Urchidae)刺螠属[19-20]，对环境适应性较强，是中国北方沿海潮间带下和潮下带浅水区常见的底栖生物，主要穴居在浅海海底泥沙中，洞穴为“U”字形，通过滤食水体中的悬浮性颗粒物来获得营养，对硫化物具有较强的耐受性和解毒能力[21]，且具有很高的经济价值和营养价值[19]，是对浅海规模化养殖区沉积物进行生物修复极具潜力的种类。目前关于单环刺螠的研究主要集中在繁殖生物学[22]、耐硫机制[23-24]、生态健康养殖[25]、活性物质提取[26]等方面，但有关单环刺螠生物扰动对生源要素生物地球化学过程的影响尚未见报道。

本研究以单环刺螠作为对象，期望探讨生物扰动作用对沉积物-水界面氮磷营养盐扩散通量的影响，并通过分析这种扰动作用对沉积物作为“营养物质蓄积库”释放营养盐过程影响的持续性，研究结果将为深入认识单环刺螠在水层-底栖系统耦合过程中的生态作用提供基础数据，并为后续将单环刺螠作为底栖生物功能群种类纳入多营养层次综合养殖系统提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

实验所用的沉积物从烟台近岸海域获得，单环刺螠(10～15 mg/尾)购自青岛市崂山区单环刺螠育苗场。培养用沉积物取自烟台近岸海域，粒度分析沉积物类型为黏土质粉砂。实验在白色塑料箱(长×宽×高=0.50 m×0.38 m×0.32 m)中进行，设置低密度(LD，500 尾/m2)、中密度(MD，2 500 尾/m2)、高密度(HD，8 300 尾/m2)处理组和1 个对照组(CO，0 尾/m2)，每组5 个重复。培养用沉积物经100 目筛网过筛并混匀后转移至白色塑料箱，厚度10 cm，重约10 kg。随后通过虹吸方式沿箱壁缓慢加入50 L 砂滤海水，微充氧。待沉积物完全沉淀5 d 后开始实验，挑选活性强、规格均匀的单环刺螠放入不同分组对应的箱子中，将白色塑料箱置于水泥池(长×宽×高=6 m×3 m×1 m)中，水泥池中注入水，水位控制在以不没过塑料箱为标准，保证所有处理水温一致。培养持续时间20 d。水体温度、盐度、pH 值以及溶解氧采用便携式多参数测定仪(Eureka water probes，美国)现场测定，实验期间水温为(10.52±0.57) °C，盐度33.48±0.18，溶解氧(9.00±0.22) mg/L，pH 值8.01±0.06。

单环刺螠的排氨率采用循环水槽培养系统下的静水呼吸室法进行测定(图1)。呼吸瓶采用435 mL 透明具盖圆柱体玻璃容器，所有容器底部均平铺180 g 经100 目筛网过筛后的沉积物(厚度约1.3 cm)，放入循环水槽使沉积物沉淀，待沉积物完全沉淀3 d 后，实验组中放入10 尾单环刺螠(10～15 mg/尾)，对照组不放单环刺螠，暂养3 d 后开始实验，每组设4 个重复。每个呼吸室加满水(350 mL)，将水槽中的海水利用功率为2.5 W 的水泵通过分水装置分流到各个呼吸室中，在流水的条件下适应30 min，关闭水泵，静置4 h，实验期间使用溶氧仪(PreSens Precision Sensing，德国)测得各呼吸室内溶解氧饱和度均维持在80%以上。实验结束后，抽取200 mL 水样进行氨氮含量的测定。实验期间水温为(10.2±0.5) °C，沉积物表面出现数个单环刺螠挖掘的光滑烟囱状小洞穴，表明单环刺螠生活状况良好。实验过程中操作人员严格遵守中国水产科学研究院黄海水产研究所的伦理规范，并按照其制定的规章制度执行。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of experimental device

1.2 样品的采集和测定

实验所用海水取自养殖场附近海域，经砂滤后使用，海水的初始NH4+、NO3-、NO2-、PO43-平均浓度分别为2.06、5.39、0.61 和0.87 μmol/L。每2 天取样1 次，为模拟自然海区水体流动的特征，每次取样后，采用虹吸法换出全部水体，并缓慢注入同等水量。上覆水水样取自距沉积物表面1～2 cm 处，采用虹吸法缓慢吸取塑料箱内各处水样，每次采集上覆水150 mL，经孔径为0.45 μm 的醋酸纤维滤膜过滤后，立即加入氯仿，-20 °C冷冻保存。另外，均匀布设10 个沉积物采样点，使用取样勺依次挖取表层(0～1 cm)沉积物20 g，混合后离心得到间隙水水样。水样的测定由德国Seal QUAATRO 营养盐自动分析仪完成，各项营养盐的具体测定方法：PO43-测定为钼蓝分光光度法；NH4+测定为苯酚-次氯酸盐比色法；NO3-测定为镉柱还原法；NO2-测定为重氮-偶氮法[27]。

1.3 扩散通量和排氨率的计算

沉积物-水界面营养盐扩散通量通过Fick 第一定律[28]公式计算：

式中，F为沉积物-水界面扩散通量[mmol/(m2·d)]，Ф为表层沉积物的孔隙度，DS为沉积物中分子的扩散系数，D0为无限稀释溶液中溶质的分子扩散系数，为沉积物-水界面的浓度梯度，Ww为沉积物的鲜重(g)，Wd为沉积物的干重(g)，2.5 为表层沉积物的平均密度与水密度的比值。沉积物-水界面营养盐扩散通量计算中，正值表示营养盐由沉积物向上覆水方向扩散，负值表示营养盐由上覆水向沉积物方向扩散。排氨率计算公式：

式中，对照组和实验组中氨氮的浓度(N)分别用下标0 和t表示，V为呼吸室的体积 (L)，n为单环刺螠的数量(尾)，t为实验持续时间(h)。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0 软件进行数据统计和分析。不同处理组间的数据差异采用单因素方差进行分析，不同字母代表具有显著差异(P＜0.05)。

2 结果

2.1 沉积物间隙水和上覆水中营养盐的溶解态氮、磷营养盐浓度变化

第2～20 天不同处理组的NH4+浓度从低密度到高密度处理组分别为0.74～84.01、1.16～112.30、1.85～92.69 μmol/L。第4～10天，各高密度和中密度处理组NH4+浓度持续增加，从第10 天开始，各组NH4+浓度开始下降。第6～12天，各高密度和中密度处理组与对照组NH4+含量具有显著差异(P＜0.05)，低密度组与对照组间没有显著差异(P＞0.05) (图2)。不同处理组NO3-沉积物间隙水的营养盐浓度分别为 0.12～7.99、0.08～8.44 和0.28～31.34 μmol/L，第12、16 和18 天NO3-浓度出现显著升高；第12～20 天，高密度处理组与对照组的NO3-含量差异显著(P＜0.05)。NO2-的浓度从低密度到高密度处理组分别为0.06～13.11、0.06～16.88 和0.06～23.49 μmol/L，与NO3-浓度变化相似，在第12、16 和18 天NO2-浓度出现升高。第12 和16 天，高密度处理组与对照组NO3-含量存在显著差异(P＜0.05)。PO43-含量范围分别为0.05～3.62、0.22～3.35 和0.18～3.21 μmol/L，处理组与对照组PO43-含量不存在显著差异(P＞0.05)。

图2 间隙水的营养盐含量(a) NH4+浓度，(b) NO3-浓度，(c) NO2-浓度，(d) PO43-浓度，不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P＜0.05)，CO、LD、MD、HD 分别为对照组、低密度组、中密度组、高密度组，下同。Fig.2 Nitrogen and phosphorus concentrations in pore water(a) NH4+concentration,(b) NO3-concentration,(c) NO2-concentration,(d) PO43-concentration.Different labels indicate significant differences (P＜0.05);CO,LD,MD and HD represent control group,low densitytreatment,medium density treatment and high-density treatment,respectively,the same below.

第2～20 天不同处理组的NH4+范围，从低密度到高密度处理组分别为0.35～11.12、0.34～17.37和0.19～12.48 μmol/L (图3)。第6 天开始，中密度和高密度处理组营养盐浓度开始增加，到实验结束时保持稳定。第4～10 天，高密度处理组与对照组NH4+含量具有显著差异(P＜0.05)。不同处理组NO3-沉积物上覆水的营养盐浓度分别为3.43～24.02、2.42～26.29 和4.20～31.80 μmol/L。第12 天开始，高密度处理组NO3-持续增加；第12～20 天，高密度处理组与对照组NO3-含量均具有显著差异(P＜0.05)。NO2-的浓度从低密度到高密度处理组分别为0.13～2.57、0.27～4.77 和0.44～7.62 μmol/L。第8 天开始，高密度处理组NO2-开始出现增加；第12、16 和18 天，高密度处理组与对照组NO3-含量具有显著差异(P＜0.05)。PO43-浓度分别为0.05～2.56、0.19～3.27 和0.95～3.98 μmol/L，高密度处理组从开始到结束呈现持续下降趋势；除第18天外，其余时间高密度处理组与对照组PO43-含量具有显著差异(P＜0.05)。

图3 上覆水的营养盐含量Fig.3 Nitrogen and phosphorus concentrations in overlying water

2.2 生物扰动条件下沉积物-水界面溶解无机氮的扩散通量

溶解无机氮(DIN)扩散通量变化范围为-77.98～722.18 μmol/(m2·d) (图4)。对照、低、中、高密度组的沉积物-水界面营养盐的平均通量分别为20.56、75.25、157.34 和341.55 μmol/(m2·d)。与对照组相比，低、中、高密度组的平均营养盐通量分别提高了57%、76%和88%。结果显示，低、中、高密度组在实验第4～10 天表现为持续增加，在第2～18 天高密度组与对照组NH4+通量存在显著差异(P＜0.05)。在本研究中，NH4+对DIN 的贡献在低、中、高密度组中分别占55%、65%和80%，表明NH4+是DIN 的主要贡献者。

图4 不同处理组的DIN 扩散通量Fig.4 DIN diffusion fluxes of different treatment groups

实验期间，处理组的NH4+扩散通量变化范围为10.6～765.3 μmol/(m2·d) (图5)。对照组NH4+扩散通量变化范围为9.6～248.5 μmol/(m2·d)。NH4+扩散通量始终表现为由沉积物向上覆水持续释放。对照、低、中、高密度组的沉积物-水界面营养盐的平均通量分别为95.93、133.53、202.47 和342.87 μmol/(m2·d)。与对照组相比，低、中、高密度组的平均营养盐通量分别提高了39%、111%和257%。与低、中密度组平均NH4+通量相比，高密度组分别提高了43.7%和23.6%。多次取样结果显示，低、中、高密度组在实验前10 天表现为持续增加，并随着单环刺螠投放密度的增加，NH4+通量呈现明显的增加趋势。低、中、高密度组与对照组NH4+通量存在显著差异(P＜0.05)。

图5 不同处理组的NH4+扩散通量Fig.5 NH4+ diffusion fluxes of different treatment groups

第2～10 天，去除单环刺螠排氨的贡献后，对低、中密度组的NH4+扩散通量没有显著影响，对高密度组的NH4+扩散通量有显著影响。第12～18 天，去除单环刺螠排氨的贡献后，对低、中、高密度组的NH4+扩散通量没有显著影响(图6)。因此，在实验后期，与未去除排氨作用相比，NH4+扩散通量变化不显著。

图6 去除单环刺螠排氨后NH4+扩散通量变化Fig.6 NH4+ diffusion fluxes of different treatment groups after removal of U.unicinctus ammonia excretion

处理组NO3-+NO2-扩散通量的变化范围为-172.05～208.63 μmol/(m2·d)，对 照组变化范围为-20.01～-156.60 μmol/(m2·d) (图7)。对照、低、中、高密度组的沉积物-水界面营养盐的平均通量分别为-65.77、-60.42、-45.05 和-12.22 μmol/(m2·d)。与对照组相比，低、中、高密度组的平均营养盐通量分别降低了8%、32%和81%。实验期间，对照组和低密度组的NO3-+NO2-的扩散通量始终表现为上覆水向沉积物迁移。第2～10 天，NO3-+NO2-的扩散通量保持稳定输出，不同处理组与对照组NO3-+NO2-通量没有显著差异(P＞0.05)。第12～20 天，NO3-+NO2-的扩散通量开始出现持续的增加，不同处理组与对照组NO3-+NO2-通量有显著差异(P＜0.05)。若只考虑上覆水向沉积物迁移，随着时间延长，所有处理组NO3-+NO2-扩散通量表现为缓慢增加的趋势，高密度组显著增加。反之，高密度组从第10 天开始出现沉积物向上覆水释放NO3-+NO2-。

图7 不同处理组的NO3-+NO2-扩散通量Fig.7 NO3-+NO2- diffusion fluxes of different treatment groups

2.3 生物扰动条件下沉积物-水界面溶解无机磷扩散通量

处理组PO43-扩散通量的变化范围为-7.85～6.42 μmol/(m2·d)，对照组PO43-扩散通量的变化范围为-4.65～8.35 μmol/(m2·d)。实验期间对照、低、中、高密度组的沉积物-水界面营养盐的平均通量分别为0.11、-0.87、-1.14 和-3.01 μmol/(m2·d)(图8)。总体来看，PO43-扩散通量在实验期间没有明显地表现出向固定方向扩散，但在实验进行的第2～14 天与对照组相比，中、高密度组PO43-通量存在显著差异(P＜0.05)。第2～6 天，处理组PO43-通量持续增加。

图8 不同处理组的PO43-扩散通量Fig.8 PO43- diffusion fluxes of different treatment groups

3 讨论

目前有关生物扰动对沉积物-水界面影响的研究多采用实验室模拟培养法、实验围隔养殖等方法[29-30]，这些方法为认识沉积物-水界面营养盐的交换速率及随时间的变化过程提供了重要手段。受潮汐、海流等影响，自然海区沉积物-水界面的海水处于不断的流动状态，上覆水也相应地在进行不断的更新，本研究采用“2 d 为一个实验时段、连续取样10 次”的方法，为探索生物扰动的作用和持续性的生态相关性研究提供了新方法。

底栖动物通过掘穴、摄食、生物灌溉、排泄等活动直接或间接影响表层沉积物中的溶质迁移和沉积物-水界面的溶质交换[30]。铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)的生物扰动可以改变底泥的结构和理化性质，同时促进氧气向沉积物中渗透[31]。在本研究中，NH4+对DIN 的贡献在低、中、高密度组中分别占55%、65%和80%，表明了NH4+是DIN 的主要贡献者，且DIN 的变化趋势也与NH4+通量的变化趋势一致。与对青蛤(Cyclina sinensis)生物扰动的营养盐通量的研究结果具有相似性[32]。

在本研究中，与对照组相比，单环刺螠的存在显著加速了NH4+由沉积物向水体的扩散，这一增量的来源一方面是单环刺螠对沉积物的扰动，影响了沉积物表层的氧化层，增加了表面氧化-厌氧层的面积与氧气含量，加快了微生物活动速率，促进了营养盐在沉积物与上覆水之间的交换。另一方面，单环刺螠自身亦会通过排氨作用向上覆水中释放NH4+。结果表明，单环刺螠的排氨作用虽然对于NH4+由沉积物向水体的扩散具有一定的贡献，但主导因素依然来源于单环刺螠的生物扰动作用[33]。同时其生物扰动作用具有持续性，即使每次取样前后换水，在第4～14 天，中、高密度组的NH4+通量与对照组相比表现为持续增加，并存在明显的密度效应。

硝化过程是沉积物氮循环的核心过程，各种底栖动物在沉积物-水界面的生物扰动很大程度上促进了沉积物的硝化和反硝化作用[34]。硝化过程包括氨氧化和亚硝酸盐氧化两个过程，氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌分别在这两个过程中发挥作用[35]。大型底栖动物的生物扰动可以提高微生物群落结构的多样性[36]，但霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)的生物扰动降低了表层沉积物中氨氧化菌群落结构和丰度[37]。因此，氨氧化菌多样性与群落结构变化随地域不同而变化，受到温度、氨氮浓度、DO、盐度、pH、光照等环境因子的影响[38]。河蚬(Corbicula fluminea)的生物扰动促进了沉积物-水界面处溶解态和吸附态的氨氮交换，加速了沉积物-水界面的硝化过程[39]。这种促进作用在研究初期硝化活动较弱时表现更加明显。底栖动物洞穴壁中的铵或者被自养硝化细菌氧化，或者通过水流进入洞穴水，随后进入上覆水[40]。在本研究中，NO3-+NO2-通量在第 12～20 天开始出现增加，且第 16 天NO3-+NO2-通量最高。出现这种变化的原因可能是由于氨氧化是硝化过程的第一步反应，是硝化反应的限速步骤，氨氧化菌是一个增殖很慢的微生物群体，前期不足以将产生的铵态氮转换为硝态氮[41]，随着时间的增加，单环刺螠在沉积物-水界面的扰动使溶解氧充分进入，再加上其产生的分泌物黏附在洞穴壁上，形成了利于氨氧化菌增殖的环境，硝化细菌数量大大增加，从而促进了硝态氮通量的释放[42]。

刺参(Apostichopus japonicus)的生物扰动作用可以有效降低沉积物中有机磷的含量[43]。同时缢蛏(Sinonovacula constricta)生物扰动下对于养殖废水生态处理系统沉积物垂直方向上的磷赋存形态具有显著的影响[44]。在本研究初期，PO43-扩散通量显著增加，但随着时间的延长，与对照组相比，从第10 天开始PO43-的扩散通量开始受到抑制。此变化的可能原因为，研究初期单环刺螠的生物扰动增加了沉积物和上覆水的交换，但是这种扰动不一定会增加磷扩散通量由沉积物向上覆水扩散，也可能表现为由上覆水向沉积物扩散，而在本研究中即表现为由上覆水向沉积物扩散。这可能是因为沉积物含水率的增加以及沉积物Fe2+的氧化，可以减少间隙水中溶解性磷酸盐(SRP)的浓度[45]，而生物扰动增加了氧的渗透，从而促进了沉积物中的二价铁氧化为氢氧化铁，随后氢氧化铁通过吸附作用生成铁结合磷，减小了间隙水中SRP 的浓度，从而影响SRP 在沉积物-水界面的活动[46]，在本研究中很可能因为单环刺螠的生物扰动效应随着时间的变化不断增强，促进了氧气的渗透，从而抑制了磷的扩散通量。

本研究虽然观测到了单环刺螠生物扰动对沉积物-水界面溶解态营养盐(尤其是溶解无机氮)扩散的促进作用，但这种促进作用的发生过程及深层次的内在机制尚不明确。微生物是海洋氮循环的主要驱动者[47]，后续研究中将聚焦单环刺螠影响下沉积物中氨化过程和硝化过程这两大关键生态过程，重点研究氨化细菌、氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)、氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)等关键功能微生物对单环刺螠生物扰动的响应，深入揭示生物扰动过程促进营养盐交换的微生物作用机制。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）