基于CRISPR/Cas9 系统构建青鳉突变体

潘启华，陆 可，罗君志，蒋月雯，夏必琳，陈 磊，王梦洋，戴荣贵，陈天圣*

(1.集美大学水产学院，农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021；2.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070)

基因编辑技术是研究基因功能的重要手段之一，其利用嵌合的核酸酶诱导靶向DNA 双链断裂来刺激细胞启动DNA 修复机制，这一机制包括容易出错的非同源末端连接和同源定向修复，从而实现有效且精确的遗传修饰[1]。作为第三代基因编辑系统，CRISPR/Cas9 是由具有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白和特异的单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA)组成的复合体[2-3]。由于其易于设计、使用简单以及高效的突变等优点，已经迅速在包括斑马鱼(Danio rerio)和青鳉(Oryzias latipes)在内的多种生物体中广泛运用[4-9]，并且成为目前分子育种的重要手段之一。

青鳉隶属于鳉形目(Cyprinodontiformes)青鳉科(Oryzlatidae)青鳉属，具有饲养简单、耐受力强、性成熟时间短、繁殖能力强、基因组和转录组信息较为完善等优点[10-12]。此外，细胞移植技术、显微注射技术、多种分子生物学技术在青鳉中的应用及其多种干细胞的建立，使其成为研究基因功能、器官发生和发育机制的良好模型[13-17]。

尽管目前已经有很多研究报道了利用CRISPR/Cas9 系统在青鳉中成功构建了突变体[18-20]，如Fang 等[4]运用CRISPR/Cas9 系统成功敲除青鳉tyr基因，导致其眼部黑色素的缺失，快速获得了白化的突变品系。Sawamura 等[21]采取双sgRNA的方法成功获得了青鳉dnd突变的F0，以及非编码RNA 突变体的构建[22]。但是这些文献中并没有构建青鳉突变体的完整详细方案和步骤，因此本研究结合已发表的文献以及本实验室敲除青鳉Olpax6.1 的经验，总结了从gRNA 的设计到获得纯合突变体的整个实验技术流程，为青鳉突变体的构建提供技术指导，同时为其他鱼类突变体的构建提供技术参考，以期对养殖品种的分子育种有所帮助。

1 材料与方法

1.1 青鳉的饲养及胚胎

青鳉HdrR 品系饲养在光照14 h、黑暗10 h的循环水系统中，每日投喂丰年虫3 次。收集胚胎时，先将性成熟雌雄鱼提前1 天用透明隔板分开，次日取出隔板使雌雄鱼自然交配产卵。待雌鱼产卵后，小心地将胚胎从雌鱼的生殖孔轻轻取下并用镊子将卵丝和胚胎分离，随后在28 °C 的恒温箱中用胚胎培养液(1.00 g NaCl、0.03 g KCl、0.04 g CaCl2·2H2O、0.16 g MgSO4·7H2O，加入 10 mL 0.01%亚甲基蓝溶液充分混匀后定容到1 L)进行培养[23]。实验过程中操作人员严格遵守实验动物伦理规范，并按照集美大学伦理委员会制定的规章制度执行。

1.2 gRNA 的设计

本研究以青鳉Olpax6.1 基因 (Gene ID：100049356)的敲除为例，首先在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到所需要的基因组序列，用Snapgene 软件(https://www.snapgene.com/)标记好外显子和内含子的位置，确定需要敲除的位置，通常gRNA 的位置应设计在靠近翻译起始位点ATG 的下游。打开ChopChop (http://chopchop.cbu.uib.no/)网站，将gene ID 放入Target 框中，也可以点击“Paste target”将Target 框中的gene ID 模式切换到基因序列模式，将基因的序列复制到Target 框中；点击In 框中选择序列相应的物种；在Using 框中选择敲除的系统，本研究主要基于CRISPR/Cas9 系统，因此在Using 框中选择CRISPR/Cas9；全部填写完成后点击“Find Target Sites！”，网页设计完成后会显示出结果。一般该设计网站会根据Efficiency 和Off-targets 给出相应的Ranking，此时应选择在基因翻译起始密码子下游Ranking 排名较前、Efficiency 高以及Off-targets少的靶位点作为候选靶点，一般至少选择3 个靶点以提高编辑的有效性。gRNA 设计完成后，再设计特异扩增该靶点的PCR 检测引物(图1)。

图1 Olpax6.1 gRNA 及检测引物的设计黑色方框代表编码的外显子，白色方框代表非编码的外显子，红色箭头代表gRNA 的位置，红色三角形代表检测引物。Fig.1 Design of Olpax6.1 gRNA and detection primersBlack boxes represent coding exons,white boxes represent non-coding exons,the red arrow represents the position of gRNA,the red triangles represent detection primer.

1.3 体外合成gRNA 和Cas9 mRNA

gRNA 模板的扩增 将组成gRNA 的scaffold 序列(5′ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT 3′)进行人工合成(武汉擎科生物科技有限公司)并连入pMD19-T 载体(TaKaRa，D102A)中形成pMD19-gRNA scaffold 质粒备用。用gRNA 的上游引物(T7 启动子+靶位点5′-3′去掉NGG 的N20 个碱基+scaffold 5′端部分序列，如靶位点为5′ tgcctggtggaatccggcag-CGG 3′，则gRNA 上游引物为gRNAF: 5′ TGTAATACGACTCACTATAGGtgcctggtggaatccggcagGTTTTAGAGCTAGAAAT 3′) (下划线为T7 启动子序列)和下游通用引物(gRNA-R: 5′ AAA AGCACCGACTCGGTGCC 3 ′)以 pMD19-gRNA scaffold 质粒为模板进行扩增。反应体系：25 μL 2× Phanta Max Master Mix (Vazyme，P515-01)，2.5 μL gRNA-F+gRNA-R (10 μmol/L)，2.5 μL pMD19-gRNA scaffold 质粒(1 ng/μL)，补充双蒸水至50 μL，总共扩增8 管。扩增条件：95 °C 3 min；95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 10 s，28 个循环；72 °C 5 min，4 °C ∞。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳后用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit (OMEGA，D2500-02)回收，最后加入15 μL RNase-free 水溶解，用NanoDrop 2000 (ThermoFisher)测定浓度待用。

Cas9 mRNA 模板的制备 先将CMV-T7的序列结构插入pT3TS-nCas9n 质粒[24]中Cas9 的上游构建pCMV-zCas9 质粒[4]，利用XbaⅠ (NEB，#R0145V)将10 μg 的pCMV-zCas9 质粒进行线性化，反应体系为pCMV-zCas9 10 μg，Cutsmart 缓冲液10 μL，XbaⅠ 4 μL，补充双蒸水至100 μL。37 °C 孵育5 h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳后用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit (OMEGA，D2500-02)回收，再加入15 μL RNase-free 水溶解，用Nano-Drop 2000 (ThermoFisher)测定浓度待用。

体外转录与纯化RNA 用TranscripAid T7 High Yield Kit (ThermoFisher，#K0441)对gRNA模板进行体外转录获得gRNA。反应体系：gRNA模板1 μg，ATP/CTP/GTP/UTP 各1 μL，5×TranscriptAid Reaction Buffer 2 μL，TranscriptAid Enzyme Mix 1 μL，补充RNase-free 水至10 μL，混合均匀。

用mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Invitrogen，AM1344)对Cas9 mRNA 模板进行转录获得Cas9 mRNA。反应体系：2×NTP/CAP 10 μL，10×Reaction buffer 2 μL，Cas9 mRNA 模板1 μg，T7 Enzyme Mix 2 μL，补充RNase-free 水到20 μL，混合均匀。

上述两种体系配制完成后，放入37 °C 水浴锅中孵育4 h。孵育完成后，取1 μL 转录后产物进行琼脂糖凝胶电泳检测转录效果。随后加入1 μL DNase Ⅰ至转录体系中，混合均匀，37 °C 孵育15 min。之后，向反应体系中加入30 μL 7.5 mol/L 的LiCl 溶液和30 μL RNase-free 水，混合均匀，-20 °C 沉淀过夜。混合液于4 °C，12 000 r/min 离心20 min，弃上清液。然后加入1 mL 75%乙醇(DEPC 水配制)悬浮沉淀，于4 °C，12 000 r/min 离心10 min 后弃上清液；重复1 次。吸干水分并自然干燥，加入20 μL RNase-free 水溶解，取1 μL 转录后产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后进行分装。gRNA 分装浓度为250 ng/μL；Cas9 mRNA 分装时每管的量为1 500～2 500 ng，体积小于4 μL，-80 °C 长期保存。

1.4 显微注射

显微注射之前需提前制作注射针和注射槽。利用拉针仪(Narishige，PC-100，图2)对外径1.00 mm、内径0.58 mm 的玻璃细管(Sutter，BF100-58-10)进行拉制获得注射针。拉针仪的程序为Lv1：86.0，Lv2：52.6，重力模块调至5。注射针拉制完成后，在体视显微镜(江南，JSZ8) 4×物镜下，用镊子轻轻触碰针尖进行断针处理(图3-a)。显微注射凹槽的制作：用无菌水配制1.5%的琼脂糖，微波炉融化后冷却至50～60 °C，倒入90 mm 培养皿中并放置显微注射凹槽模具(图3-b，c)，待琼脂糖凝固后，用镊子拔出凹槽模具即可(图3-d)。凹槽模具为有机玻璃自制。利用微量上样枪头(Eppendorf，E270452J)将终浓度为300～500 ng/μL的Cas9 mRNA、终浓度为30～50 ng/μL 的gRNA以及终浓度为0.1%的酚红注射混合液加入针管中，随后将针管插入固定在显微操作器的亚克力夹持器(图2)上。将前一晚隔离雌雄鱼的隔板抽出，使雌雄鱼进行交配和自然产卵，15～30 min 后将悬挂在雌鱼泄殖孔的胚胎轻轻取下，放入盛有胚胎培养液的培养皿中。在体视显微镜下用镊子将黏附在胚胎上的丝状物剥离，用巴氏吸管将分离的胚胎转移到注射凹槽中，在体视显微镜2.5×视野下将细胞团翻转朝上，调节显微注射系统(Warner，PL-100A，图2)压力，将注射时间调节为0.2～0.3 s，注射压调节为70 kPa，平衡压调节为20 kPa，用手指调节显微操作器(图2)以控制针的方向，用脚踩在脚踏板上控制注射开关，将混合液注射到青鳉胚胎的1 细胞中。注射完成后用胚胎培养液培养胚胎，并置于28 °C 恒温光照培养箱中培养。

图2 显微注射操作系统Fig.2 Microinjection operating system

图3 青鳉显微注射的针与模具的制备(a)注射针断与未断的对比，比例尺：100 μm；(b)显微注射凹槽模具的侧视图；(c)显微注射凹槽模具的俯视图；(d)琼脂糖凝胶制备的显微注射凹槽。Fig.3 Preparation of needle and mold for microinjection of O.latipes(a) comparison of broken and unbroken injection needles,scale bar: 100 μm;(b) side view of microinjection groove mold;(c) top view of microinjection groove mold;(d) preparation of microinjection groove using agarose gel.

1.5 突变位点的体内检测

将注射后的胚胎培养至第4 天，随机选取8个胚胎，用碱裂解法分别提取单个胚胎的基因组DNA，实验方法：取单个胚胎，加入50 μL 50 mmol/L 的NaOH 溶液，95 °C 孵育处理30 min，取出冷却后，加入10 μL 0.5 mol/L 的Tris-HCl 溶液混匀。以基因组DNA 为模板，用检测引物对gRNA 靶点进行PCR 扩增。引物为DF：5′ TTT GCTCATTGATACTGTTGTGGGT 3′，DR：5′ ATG TCATGCCTTTGTTGCCC 3′。扩增体系为2 μL 粗提基因组DNA，5 μL 2×NG PCR MasterMix (HLingene，NG001S)，0.5 μL DF+DR (10 μmol/L)，2.5 μL 双蒸水。扩增条件为95 °C 3 min；95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，35 个循环；72 °C 5 min，4 °C ∞。扩增后利用T7 Endonuclease Ⅰ (T7E1，Vazyme，EN3030-01)对PCR 产物进行酶切检测突变情况，实验过程：取5 μL PCR 产物在95 °C PCR 仪变性5 min 后快速取出，在室温条件下放置10 min，使其从95 °C 缓慢降至室温。向变性后的PCR 产物加入4 μL 双蒸水，1 μL 10×T7 Endonuclease Ⅰ Reaction Buffer 以 及0.1 μL T7 Endonuclease Ⅰ，混匀后37 °C 孵育30 min。孵育完成后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若其显示出多条带，则PCR 片段有突变，反之则没有突变。进一步将阳性的PCR 产物进行测序(生工生物工程上海股份有限公司)，在靶位点附近出现双峰为突变。检测完成后将有突变的同批次胚胎培养至F0成鱼。

1.6 纯合子突变体的筛选

将F0成鱼与野生型成鱼进行交配，随机挑选杂交后的8 个胚胎进行突变检测，检测步骤同上所述。若有突变则大量收集该组胚胎养至成鱼，即为F1。剪F1尾鳍，经碱裂解法粗提基因组DNA，利用PCR 和T7E1 酶切对靶位点进行突变的鉴定，若有突变，则将其PCR 产物连接pMD18-T 载体(TaKaRa，D102A)进行单克隆测序。根据测序结果，将突变类型相同的F1成鱼进行杂交并大量收集该组胚胎养至成鱼，即为F2。纯合子突变体的筛选过程如图4 所示，剪F2成鱼尾鳍碱裂解法粗提基因组DNA，利用PCR 和T7E1 酶切对靶位点进行突变的鉴定，此时PCR 酶切产物中出现多条带的个体为杂合突变体，若为单一条带则是未突变个体和纯合突变体。为了进一步区分未发生突变个体和纯合突变体，按照1∶1 的比例向单一条带的PCR 产物中加入野生型的PCR 产物，再用T7E1 酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳产生多条带的酶切产物则为纯合突变体，其余的为未突变个体。最后将T7E1 酶切初筛为纯合突变体的PCR 产物进行测序以确定缺失的序列，从而确定纯合突变品系。

图4 青鳉纯合子突变体的筛选过程Fig.4 Screening process of O.latipes homozygotes

2 结果

2.1 gRNA 与Cas9 mRNA 体外合成的结果

通过PCR 从pMD19-gRNA scaffold 质粒中扩增获得了gRNA 的模板(图5-a)，模板纯化后进行体外转录获得gRNA 模板与gRNA 的混合物(图5-b)，利用DNase Ⅰ对混合物处理并纯化后，获得了条带单一且无明显降解的gRNA (图5-c)。将pCMVzCas9 质粒酶切后，从电泳图可以看出质粒被完全切开，大小为8 029 bp (图5-d)，进一步将其作为模板进行体外转录。对比质粒酶切后的电泳图(图5-d)，转录后的电泳图显示出2 条带(图5-e)，其中较大的条带为质粒模板，较小的条带为Cas9 mRNA。同样的，利用DNase Ⅰ对其进行处理并纯化获得了Cas9 mRNA，电泳后的目的条带与预期的条带大小基本一致(图5-f)。

图5 RNA 的模板及体外转录(a) PCR 扩增的gRNA；(b)体外转录后的gRNA；(c)纯化后的gRNA；(d)线性化的pCMV-zCas9；(e) Cas9 体外转录后的mRNA；(f) Cas9 mRNA 纯化后的检测。1.DL100 marker，2.扩增的gRNA，3.转录后的gRNA，4.纯化后的gRNA，5.1 kb marker，6.线性化的pCMVzCas9，7.DL500 marker，8.Cas9 体外转录后的mRNA，9.纯化的Cas9 mRNA。Fig.5 Template and in vitro transcription of gRNA(a) amplified gRNA template;(b) in vitro transcripted gRNA;(c) purified gRNA;(d) linearized pCMV-zCas9 vector;(e) in vitro transcripted Cas9 mRNA/DNA mixture;(f) purified Cas9 mRNA.1.DL100 marker,2.amplified gRNA,3.transcripted gRNA,4.purified gRNA,5.1 kb marker,6.linearized pCMV-zCas9,7.DL500 marker,8.transcripted Cas9 mRNA,9.purified Cas9 mRNA.

2.2 酚红标记胚胎显微注射的位置

青鳉卵子受精后，胚胎中的油球开始由动物极向植物极移动，胚盘向下凹陷被油球环绕(图6-a)，此时将胚盘朝右上方倾斜并将针扎入胚胎的胚盘中进行注射(图6-b)。注射完后，酚红在向下凹陷的胚盘中而没有散开，说明注射成功(图6-c)。

图6 青鳉胚胎的显微注射(a)注射前；(b)注射中；(c)注射后。Fig.6 Microinjection of medaka embryo(a) before injection;(b) during injection;(c) after injection.

2.3 突变位点的检测

收集注射4 d 后的胚胎提取基因组DNA，并对gRNA 靶位点片段进行扩增，将扩增得到的PCR 产物利用T7E1 进行酶切，结果显示PCR 产物能够被T7E1 切割形成两种大小不同的片段(图7)。进一步的PCR 产物测序结果显示，在靶位点附近出现双峰(图7)，这说明了gRNA 和Cas9 mRNA 的注射导致了靶位点基因序列的突变。

图7 突变位点的检测M.marker；1～8.注射的胚胎；C.野生型胚胎。在测序波峰图中，蓝色方框标记gRNA 的序列，黄色高亮标记PAM 序列，红色方框表示突变的序列，红色箭头指向重叠峰的位置。Fig.7 Detection of mutation sitesM.marker;1-8.injected embryos;C.wild-type embryos.In the sequencing waveform,the gRNA sequence is marked by the blue box,the PAM sequence is highlighted by yellow color,red boxes represents mutated sequences,and the red arrow points to overlapping peaks.

2.4 F2 纯合子的获得

按照前述方法筛选F2成鱼，在21 尾中有12尾的PCR 产物能够被T7E1 切割，说明这些是杂合子(1、4、5、6、8、9、10、11、14、16、18和21)。将其他未被切开的PCR 产物加入野生型的PCR 产物后进行T7E1 酶切，结果显示有3 尾鱼的PCR 产物能够被T7E1 切割，表明这些个体为纯合子(7、17 和20)，其余未被切开的为野生个体(2、3、12、13、15 和19) (图8-a)。进一步的PCR 产物测序证实了7、17 和20 为纯合子，从而得到了纯合突变品系。该纯合子的表型为典型的pax6 突变表型，其眼部发育不完整(图8-b)。

图8 纯合F2 的筛选及表型分析(a)纯合F2 的筛选过程。M.marker；1～21：不同个体；C 代表野生型。黑色数字代表杂合子，红色数字代表非杂合子，蓝色高亮的红色数字代表纯合子；(b)野生型和纯合子测序波峰图以及表型对比，蓝色方框标记gRNA 的序列，黄色高亮标记PAM 序列，红色方框表示突变的序列，白色箭头指向眼部畸形发育的位置，比例尺为200 μm。Fig.8 Screening and phenotype analysis of F2 homozygous(a) screening process of homozygous F2.M.marker;1-21.different individuals;C.wild type.Black numbers represent heterozygotes,red numbers represent non-heterozygotes,red numbers highlighted in blue represent homozygotes;(b) comparing the sequencing waveform and phenotype between wildtype and homozygotes,where the gRNA sequence is marked by blue box,the PAM sequence is highlighted by yellow color,the red box represents the mutated sequence,and the white arrow points to the location of the eye malformation development.Scale bar: 200 μm.

3 讨论

生物特异基因突变体的构建是研究基因功能的重要手段之一，本研究详细描述了青鳉突变体的构建过程。本研究中，gRNA 的设计主要在ChopChop 网站中进行，此外还有CCtop (https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/)、CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)以及Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)等一系列gRNA 设计网站可供选择[25]。CCTop 网站根据主页中指定的参数扫描输入序列以识别gRNA 目标位点，根据候选的目标位点确定潜在的脱靶位点，并根据潜在脱靶位点匹配到的最接近的外显子给出相应的分数从而进行排序[26]。CRISPOR 网站也可以计算脱靶分数、所有效率分数、CG 含量警告，其改进的脱靶和靶位点预测算法可减少筛选脱靶和有效位点序列所花费的时间[27]。Cas-OFFinder 可自行设定所需的PAM 序列或错配碱基的数量，对已测序基因组中的潜在脱靶位点进行快速搜索[28]。研究者可根据研究目的选择合适的方法进行gRNA 的设计。

设计完成gRNA，实验以含有gRNA scaffold 的质粒为模板，通过合成含T7 启动子的上游引物和通用的下游引物对该质粒进行扩增，获得gRNA 体外转录的模板，利用T7 体外转录试剂盒转录获得了gRNA。在其他研究中报道了可通过合成含T7 启动子、靶位点以及scaffold 的上游引物和下游引物直接退火形成gRNA 体外转录的模板，再利用体外转录试剂盒转录获得gRNA[29]。

在显微注射时，本研究采用了300～500 ng/μL的Cas9 mRNA、30～50 ng/μL 的gRNA 注射浓度。在其他研究中，如Kato-Unoki 等[30]在青鳉中的注射浓度为100 ng/μL 的Cas9 mRNA 和25 ng/μL 的gRNA。Gay 等[18]在青鳉中的注射浓度为100 ng/μL的Cas9 mRNA 和25 ng/μL 的sgRNA。Meneghetti等[31]在斑马鱼中的注射浓度为400 ng/μL 的Cas9 mRNA 和50 ng/μL 的gRNA，同样能引起生物体基因的突变。而对于注射Cas9 mRNA 也可用Cas9 蛋白代替，在斑马鱼中注射Cas9 蛋白和gRNA 比注射Cas9 mRNA 和gRNA 所引起的突变率更高[32-33]，这种差异可能是gRNA/Cas9 蛋白复合物可立即诱导胚胎突变所导致。当注射gRNA/Cas9 mRNA 时，Cas9 mRNA 必须先翻译成蛋白质才能与gRNA 结合，从而诱导DNA 双链断裂。Cas9 蛋白的诱导表达以及纯化过程相较于Cas9 mRNA 的体外合成更为复杂，因此建议合成Cas9 mRNA 或购买商品化的Cas9 蛋白。本研究所用注射针的针尖长度是综合不同研究后所确定，其与Porazinski 等[17]所制的针尖长度较为一致，而在方健[34]的研究中，其注射针尖更短，这使得断针时需要十分小心，否则针口过大，更容易对胚胎造成机械损伤，从而导致胚胎畸形率的上升，当然针尖越短其进入卵壳硬的胚胎中更容易。关于注射部位，由于青鳉卵属于单一卵黄块类型的卵，其原生质只能从卵黄表面移向动物极形成胚盘，而核酸分子无法通过卵黄质边界，因此只能将Cas9 mRNA 和gRNA 的混合液注射到胚盘中。类似的鱼类还有条斑星鲽(Verasper moseri)等[35]。而如斑马鱼、金鱼(Carassius auratus)等鱼类的卵属于含多个卵黄颗粒的卵，分子能够随着胚胎的发育与原生质一起转移到胚盘中，因此可将Cas9 mRNA 和gRNA 的混合液注射到胚盘或者卵黄区域[35]。尽管青鳉的1 细胞期持续时间为30～45 min，但随着时间的延长，其卵壳也会变得越来越硬而不利于注射，因此推荐在受精后15～30 min 进行注射，此时卵壳较软，胚盘较为明显，相关的操作视频可参考JOVE 网站[17]。

为了验证靶位点的有效性，本研究主要通过显微注射活体后对靶位点测序验证。然而在一些显微注射存在难度的鱼类中，需要先在体外验证gRNA 的有效性，再进行注射，以提高突变效率[5]。检测到胚胎的突变后，将这些胚胎养至成鱼形成F0。由于F0中同一尾鱼存在不同组织的突变类型可能不一样，甚至同一组织中仍可能出现多种突变类型，为了获得纯化的可遗传的突变类型，需要将突变体同野生鱼进行杂交获得F1。若从F1中能够检测到突变，则认为该F0的突变是可遗传的。由于从同一亲本产生的F1中，仍可以筛选到2 种以上的突变类型，因此在F1筛选过程中，需要经过单克隆测序确定发生无义突变的相同类型，然后将同种无义突变类型的F1成鱼进行自交从而获得F2。突变体筛选可通过T7E1 酶切进行，也可通过PCR 的方法进行验证。如Iyer 等[5]针对突变位点序列的扩增可一步鉴定出纯合子、杂合子以及野生型个体，此方法对突变的序列、引物的设计及PCR 退火温度有一定的要求。

本研究以青鳉Olpax6.1 基因的敲除为例，阐述了利用CRISPR/Cas9 系统在青鳉中构建突变体的详细过程，涵盖了基因特异gRNA 的设计、gRNA 及Cas9 mRNA 的体外合成、显微注射、突变检测以及纯合子的筛选过程，为青鳉突变体的构建提供了详细的实验操作流程，同时也为其他鱼类乃至其他类型动物的突变体构建提供技术参考。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）