正交试验优化鱼鳔抗氧化肽的提取工艺

郭 鑫，夏子怡，吴 波，夏广清*，臧 皓*

鱼鳔是多数硬骨鱼类具有的一种呼吸辅助器官［1］.鱼鳔可分为新鲜鱼胶和干制鱼胶，干制后呈现淡黄色、角质状［2］，常用于缓解肾虚滑精等症状［3］.鱼鳔的化学成分包括粘性蛋白、矿物质和维生素等，其中蛋白含量高达79%［4］.目前，鱼鳔作为鱼类产品生产中的附属品，其功能性并未得到高度重视，导致鱼鳔的利用率较低.

蛋白质和多肽在生物体内发挥着重要作用，可调节生理功能，包括清除体内自由基，调节身体亚健康等多种症状［5-6］.董倍余等［7］采用水酶法制备鲫鱼多肽，该多肽具有较强清除DPPH 自由基的能力.周勰等［8］采用水酶法制备乌贼缠卵腺多肽，结果显示该多肽对羟自由基等具有良好的清除能力且呈现剂量依赖性.张丽娜等［9］发现鱼籽多肽可通过清除ROS 降低细胞氧化应激水平，进而提高抗氧化能力.多数研究表明，动物类多肽具有较好的抗氧化活性且和相对应的提取工艺有关.因此，本文对鱼鳔多肽的提取工艺进行了优化，以期为进一步的活性评价提供理论基础.海洋类动物的蛋白与多肽大部分具有用药剂量小、效果好等优点［10-11］，因此具有较广阔的发展前景.本研究采用水酶法进行提取，参照小球藻多肽的方法［12］，优化了提取鱼鳔多肽的工艺.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干燥鱼鳔，通化皇嘉鹿业有限公司；碱性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索莱宝公司.ReadMax1900Plus 型光吸收酶标仪，上海闪普生物科技公司.

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶解法制备鱼鳔多肽工艺

取干燥鱼鳔，称量，剪碎，放入水中浸泡，4 ℃过夜后，温度60 ℃煮1 h，倒入组织捣碎匀浆机，搅拌30 min，待其变成黏液状物质后，水浴60 ℃下1 h 进行两次提取，并合并滤液，冷却至室温后进行pH 调节，随后加入酶酶解（表1），待酶解结束后沸水中灭酶10 min，离心，取上清液置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥50 h，即得鱼鳔多肽.

表1 不同蛋白酶最适水解参数

1.2.2 碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽的工艺优化

单因素实验：考查酶解过程中pH、酶添加量、酶解时间和酶解温度对ABTS 清除率的影响.固定反应条件中酶添加量10 000 U/g，酶解时间5 h，酶解温度60 ℃，考察溶液pH（7、8、9、10、11）对ABTS 清除率的影响；固定反应条件pH 9，时间5 h，温度60 ℃，考察酶添加量（6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g）对ABTS 清除率的影响；固定反应条件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解温度60 ℃，考察酶解时间（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）对ABTS 清除率的影响；固定反应条件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解时间5 h，考察酶解温度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）对ABTS清除率的影响.

正交试验设计：根据碱性蛋白酶最适水解条件及单因素试验结果，选用正交试验探究各条件间的交互作用对ABTS 清除率的影响，进而得到鱼鳔多肽酶解的最佳工艺（表2）.

2 结果与分析

2.1 各蛋白酶最适条件下的ABTS 清除率

如图1 所示，不同蛋白酶酶解多肽的ABTS清除率存在一定的差异，但均呈现剂量依赖性，随着多肽剂量的增加，ABTS 清除率不断升高.在各个浓度显示的结果当中，碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽ABTS 清除率均显著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解多肽；在浓度为5 mg/mL时，碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽的ABTS 清除率最大，为91.32%±3.21%，胰蛋白酶酶解鱼鳔多肽的ABTS 清除率为80.53%±3.24%，胃蛋白酶酶解鱼鳔多肽的ABTS 清除率最低，为52.63%±1.34%.比较三种不同蛋白酶酶解鱼鳔多肽的情况，在后续的实验中选取具有更高ABTS 清除率的碱性蛋白酶进行鱼鳔多肽酶解工艺的优化.

图1 各蛋白酶最适条件下的ABTS 清除率

2.2 碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽单因素试验结果

2.2.1 pH 对碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽ABTS清除率的影响

图2 显示，ABTS 清除率随溶液pH 值的增大而逐渐增加，当pH 值为10 时，达到ABTS 清除率的最大值；但随着pH 值继续增大，反而抑制了ABTS 的清除率.因此，在本试验条件下，适宜的pH 值为10.

图2 pH 对ABTS 清除率的影响

2.2.2 酶添加量对碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽ABTS 清除率的影响

图3 显示，酶添加量小于12 000 U/g 时，ABTS 清除率呈显著升高趋势（P<0.05），酶添加量为12 000 U/g 时，ABTS 清除率达到最大值.因此，选择酶添加量12 000 U/g 时为最佳.

图3 酶添加量对ABTS 清除率的影响

2.2.3 酶解时间对碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽ABTS 清除率的影响

图4 显示，ABTS 清除率在3～6 h 之间显著提高（P<0.05），鱼鳔多肽的ABTS 清除率随酶解时间的延长不断增加，6 h 时达到最大值，随后，ABTS 清除率变化不显著（P>0.05）.考虑成本等原因，选择6 h 作为适宜酶解时间.

图4 酶解时间对ABTS 清除率的影响

2.2.4 酶解温度对碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽ABTS 清除率的影响

图5 显示，温度在45～60 ℃时，鱼鳔多肽ABTS 清除率显著提高（P<0.05），此时鱼鳔多肽ABTS 清除率达到最大值.温度高于60 ℃后，鱼鳔多肽可能有部分发生变性，鱼鳔多肽的ABTS 清除率下降.所以选择适宜酶解温度为60 ℃.

图5 酶解温度对ABTS 清除率的影响

2.3 碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽正交试验结果

在单因素实验基础上，采用正交试验筛选出最佳工艺参数（表3）.

表3 正交试验设计及结果

影响碱性蛋白酶酶解鱼鳔多肽工艺的主次因素分别为酶添加量、酶解时间、酶解温度和pH，最佳提取条件是A1B3C1D1.在此条件下，测得鱼鳔多肽为2 mg/mL 时，ABTS 清除率为43.25%±0.95%.

3 结语

本研究以鱼鳔多肽的ABTS 清除率作为评价指标进行最优酶的筛选和进一步的工艺优化，采用正交试验优化鱼鳔多肽的提取工艺，得到最优的提取方案，即：提取pH 9、酶添加量10 000 U/g、时间5 h、温度60 ℃.本试验确定了鱼鳔多肽的最佳提取方案，可为鱼鳔多肽的现代应用提供参考，为鱼鳔食品药品的相关方向研究与开发提供依据.