蒙花锚肝宁片质量标准研究

问静，韩达斌，汪永明，王永晶，祁彦凯，刘海青，刘学良（青海省药品审评核查中心，西宁 810007）

蒙花锚肝宁片是由椭圆叶花锚（Halenia ellipticaD.Don）的带花全草经70%乙醇提取、浓缩后加工制成的浸膏片，具有清“协日”，利胆退黄的功效，临床用于治疗“协日”热引起的肝胆热症，黄疸[1]。椭圆叶花锚，藏名甲地然果，为龙胆科植物椭圆叶花锚的干燥地上部分，花期采收，全草入药，产于西藏、青海、云南、贵州等地，文献记载该药材具有清热利湿，平肝利胆之功效[1-3]。目前，蒙花锚肝宁片收载于《卫生部药品标准 蒙药分册》[1]，只有性状、薄层鉴别及检查项（片剂制剂通则项目），专属性不强，无含量测定项目。为了更全面地控制该产品的内在质量，本试验将蒙花锚肝宁片进行定性定量研究，建立了椭圆叶花锚的薄层色谱鉴别方法，采用高效液相色谱法对椭圆叶花锚中主要成分进行了含量测定研究。研究证明，该方法简便快捷，专属性强，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters 2998型二极管阵列检测器（美国沃特世有限公司），ME204电子天平[感量0.1 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，XS105DU型分析天平（感量0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），SB25-12DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），Milli-Q2355型超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药

木犀草素（批号：111720-202111，含量：99.1%）、熊果酸（批号：110742-200517，含量：99.3%）、当药苷（批号：111742-200501，含量：99.27%）、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮（批号：111744-200501，含量：100.0%）（中国食品药品检定研究院）。甲醇（色谱纯，德国默克股份两合公司）；磷酸（色谱纯，上海安谱试验科技股份有限公司）；水为超纯水。硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）。5批蒙花锚肝宁片样品（规格：0.25 g，批号：190803、190804、190805、190806、190807，三普药业有限公司）。椭圆叶花锚药材采自青海省互助县北山林场（2022年7月29日花期采集），经青海省药品审评核查中心刘海青主任药师鉴定为椭圆叶花锚的干燥带花全草，在试验中作为对照药材使用。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别[4-9]

图1 1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮TLC鉴别图（T：19℃，RH：43%）Fig 1 TLC chromatography of l-hydroxy-3，4，5-trimethoxyxanthon（T：19℃，RH：43%）

2.1.2 熊果酸的鉴别 分别取5批次蒙花锚肝宁片，除去包衣，研细，各称取0.25 g，置具塞锥形瓶中，加5 mL乙酸乙酯超声处理（频率35 kHz，功率350 W）15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取椭圆叶花锚对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。阴性样品溶液按处方比例去除椭圆叶花锚，并按供试品溶液方法制备。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则 0502）试验，吸取上述 4种溶液各4 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃加热至斑点显色清晰。在日光下检视，供试品在与对照色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。后置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点，阴性样品无干扰（见图2）。

图2 熊果酸TLC鉴别图（T：23℃，RH：38%）Fig 2 TLC chromatography of ursolic acid（T：23℃，RH：38%）

2.2 含量测定[10-17]

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Waters SunFir ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5µm），用甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱（见表1），流速为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为254 nm；进样量为5 µL。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品7.13 mg，1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮对照品14.30 mg，当药苷对照品10.10 mg，分别置100 mL、20 mL、100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.0707 mg·mL-1的木犀草素对照品溶液，0.7150 mg·mL-1的1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮对照品溶液，0.1003 mg·mL-1的当药苷溶液。取上述3种对照品溶液2 mL、5 mL、1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含木犀草素0.0028 mg·mL-1、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮0.0715 mg·mL-1、当药苷0.0020 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取蒙花锚肝宁片样品（批号：190803）适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22 µm滤过，取续滤液作为HPLC测定供试品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 蒙花锚肝宁片由椭圆叶花锚单味药材制成，故阴性样品溶液为取辅料按供试品溶液的制备方法制得。

2.2.5 专属性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5 µL，进样测定，采用外标两点法对峰面积和进样浓度进行计算。在本文色谱条件下木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷与样品中其他成分分离良好，阴性样品无干扰，理论板数均不低于3000，与样品中其他相邻成分分离度均大于1.5（见图3）。

图3 蒙花锚肝宁片HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of Menghuamao Ganning tablet

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，稀释成系列浓度对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量对峰面积进行回归，计算回归方程及线性范围，结果见表2。3种成分在相应范围内与峰面积线性关系良好。

表2 3种成分的回归方程、线性范围及相关系数Tab 2 Regression equation，linearity and correlation coefficients of 3 components

2.2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，测得木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷峰面积RSD分别为1.4%、0.13%、1.2%，结果表明方法精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、8、16、24 h进行测定，记录峰面积，测得木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷峰面积RSD分别为1.0%、0.57%、0.69%，结果表明供试品中木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取蒙花锚肝宁片样品（批号：190803）6份，按“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，计算木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷平均含量分别为1.057 mg/片、4.936 mg/片、0.194 mg/片，其RSD分别为0.49%、0.92%、0.86%。结果表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收试验 精密称取木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷对照品适量，经稀释得到质量浓度依次为0.0419 mg·mL-1、0.1964 mg·mL-1、0.0079 mg·mL-1的混合对照品溶液。称取蒙花锚肝宁片样品（批号：190803）9份，每份0.1 g，研细，精密称定，置锥形瓶中，3份一组，每组分别精密加入上述混合对照品溶液5、10、15 mL，再依次加甲醇20、15、10 mL，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷低、中、高平均回收率及RSD值分别为98.92%（1.3%）、98.52%（0.97%）、98.28%（1.2%），97.15%（1.3%）、97.65%（1.0%）、96.76%（1.2%），99.26%（0.84%）、98.35%（1.1%）、97.65%（0.72%），表明该方法准确度良好。

2.2.11 样品含量测定 5批次蒙花锚肝宁片粉末各取约0.1 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，并计算各批次蒙花锚肝宁片中木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮、当药苷的含量。结果5批次蒙花锚肝宁片中木犀草素含量在0.75～1.05 mg/片、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮含量在3.88～5.02 mg/片、当药苷含量在0.12～0.20 mg/片，见表3。

表3 样品含量测定结果(n＝5)Tab 3 Content of samples (n＝5)

3 讨论

3.1 薄层色谱展开剂的考察

蒙花锚肝宁片是由椭圆叶花锚提取制成的单方制剂，在《卫生部药品标准蒙药分册》中仅有对照药材的薄层鉴别方法，专属性不强。本试验在对照药材的基础上增加了1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮对照品的鉴别，分别考察了石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（7∶3）、石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯-水（10∶4∶4∶1）、石油醚（60～90℃）-丙酮（7∶3）、环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（15∶5∶2）等不同展开剂，最终选择石油醚（60～90℃）-丙酮（7∶3）作为展开剂。同时，参考《中国药典》2020年版一部山楂项下鉴别方法及其他文献，以硅胶G板，甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，建立了蒙花锚肝宁片中熊果酸的薄层鉴别方法。经方法学验证，上述两个薄层色谱鉴别方法无阴性干扰，斑点清晰，分离良好，专属性、重复性、耐用性均符合要求，可以用于蒙花锚肝宁片的鉴别。

3.2 对照品的选择和色谱条件的确定

在含量测定预试验中，参考相关研究文献，结合木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮和当药苷3种对照品溶液的紫外光谱扫描结果，最终选择紫外检测波长为254 nm。同时对甲醇-水，甲醇-冰醋酸溶液，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相进行考察，结果以甲醇-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱时基线较平稳，对待测组分峰无干扰。

3.3 样品结果分析

试验结果发现，蒙花锚肝宁片5批次样品之间被测成分木犀草素、1-羟基-3，4，5-三甲氧基酮和当药苷含量差距较小，分析其原因，一方面因蒙花锚肝宁片为独家品种，从国家药品监督局网站查询显示，蒙花锚肝宁片只获批一个批准文号（国药准字Z63020121），生产企业为三普药业有限公司，样本量较少；另一方面，经与企业质控人员进行沟通，得知企业所用椭圆叶花锚为青海地产药材，每年固定在青海省大通县境内、药材花期进行采集，产地和来源相对稳定，药品生产工艺简单，从而使得样品中有效成分含量相对稳定。

本试验首次建立了蒙花锚肝宁片2种有效成分的定性鉴别及3种有效成分的HPLC定量测定的方法，并进行了方法学考察，该方法简便、高效、准确，能够为蒙花锚肝宁片的质量控制提供参考依据。