基于TLR4、NF-κB信号通路探讨当归拈痛汤治疗痛风性关节炎的作用机制

刘毓，杨钊田，孙理军（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少致使尿酸盐在关节囊、滑膜囊、软骨、骨质等处沉积结晶而引起的慢性关节炎[1]，证属中医学“痹证”范畴，发作时关节红肿热痛，湿热蕴结、阻滞关节等是其基本病机[2-4]。目前，GA急性发作期的主要治疗方法包括抑制炎症反应、促进尿酸排泄，但临床效果不理想，不良反应明显[5]。当归拈痛汤具有清热利湿、疏风止痛的效果，治疗GA有较好的疗效[6]。基于此，本研究利用网络药理学方法挖掘当归拈痛汤改善GA的潜在作用靶点及信号通路，结合体内实验验证，探讨当归拈痛汤对GA的作用机制，为当归拈痛汤用于临床治疗提供理论基础和依据。

1 材料

1.1 试药

当归拈痛汤组成为羌活15 g，防风9 g，升麻3 g，葛根6 g，麸炒白术3 g，当归9 g，党参6 g，甘草15 g，苦参6 g，黄芩3 g，盐知母9 g，茵陈15 g，猪苓9 g，盐泽泻9 g，苍术9 g（陕西中医药大学第二附属医院）。双氯芬酸钠缓释片（规格：75 mg/片，北京诺华制药有限公司，批号：H10980297）。尿酸钠盐（MSU，美国Sigma公司，货号：U2875-5G），HE染液（珠海BASO公司，货号BA4025），Anti-NFκBp65（RELA）抗体（武汉boster公司，货号A00284-1），抗兔/抗小鼠二抗（上海威奥公司，货号WB0177/WB0176），IL-1β、IL-13 ELISA试剂盒（武汉boster公司，货号分别为EK0393、EK0900），TNF-αELISA试剂盒（NOVUS公司，货号VAL902）。

1.2 动物

SPF级雄性SD大鼠24只，体重（200±20）g [成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030]，22～27℃饲养于陕西中医药大学中药药理实验室动物房，动物自由饮水摄食。本研究中动物实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准同意（批件号：SUCMDL20210305006）。

1.3 仪器

BX51显微镜（日本奥林巴斯），165-8001电泳仪、170-3930转膜仪（美国Bio-Rad），TL-2010S组织匀浆器（北京鼎昊源公司），Fresco21台式高速冷冻离心机、MutiskanTM GO全波长酶标仪（美国Thermo），TGL-16B高速台式离心机（上海安亭公司），BS-220生化分析仪（深圳迈瑞公司）。

2 方法

2.1 网络药理学预测

2.1.1 当归拈痛汤方有效成分及靶点的筛选 当归拈痛汤由羌活、防风、升麻、葛根、白术、当归、党参、甘草、苦参、黄芩、知母、茵陈、猪苓、泽泻、苍术十五味药组成，通过TCMSP（https：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库获得方中各中药的化学成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18进行活性成分筛选。

2.1.2 GA的候选靶点的筛选 分别在OMIM（https：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库以“gouty arthritis”为检索词进行检索，获得GA的相关靶点基因。对两数据库检索结果进行筛选合并去重，得到疾病相关靶点。

2.1.3 PPI蛋白相互作用网络构建 将当归拈痛汤与GA的共同靶点导入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）数据库中，以人为目标物种，生成TSV文件。最终将其导入Cytoscape 3.6.1软件中构建蛋白互作网络（PPI）。

2.1.4 关键靶点GO分析及KEGG富集分析 为了探究当归拈痛汤在治疗GA过程中涉及到的生物学功能和途径，本研究使用R语言对候选靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，P值小于0.05的GO术语或KEGG通路被认为是有显著意义的。

2.2 实验用药制备

2.2.1 MSU溶液的制备 将1000 mg MSU，充分研磨后，加入36 mL 0.9%氯化钠溶液，再加入4 mL吐温-80（两者体积比为 9∶1），再加入1 mL 1.5 mol·L-1NaOH，加热搅拌，配制成25 mg·mL-1的MSU混悬液，4℃保存，用前摇匀。

2.2.2 双氯芬酸钠混悬液的制备 将200 mg双氯芬酸钠缓释片溶于299 mL超纯水中，制成质量浓度为0.67 mg·mL-1的双氯芬酸钠混悬液，密封。

2.2.3 当归拈痛汤制备 称取处方量中药饮片，于煎药煲中加入800 mL蒸馏水将各味药物浸泡30 min。武火煮沸后转文火煎煮40 min，将药液倒出备用。往药煲中加入600 mL蒸馏水进行二次煎煮，武火煮沸后文火煎煮30 min。将两次煎煮所得药液混合，纱布过滤后转移至旋转蒸发仪中浓缩至0.56 g·mL-1。冷却后装入灭菌50 mL离心管中-20℃保存备用。

2.3 实验分组及造模

将24只雄性SPF级SD大鼠标准饲料适应性喂养1周后进行编号（1～24号），采用随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、双氯芬酸钠组、当归拈痛汤中药组，每组各6只。除空白对照组外，其余3组大鼠参照Coderre等[7]造模方法予大鼠右后侧踝关节一次性注射25 mg·mL-1MSU溶液0.2 mL，建立急性GA模型，以关节囊对侧鼓起为注入标准。空白对照组大鼠右后侧踝关节注射0.2 mL生理盐水。于造模后开始灌胃给药，每日1次，灌药周期参照临床治疗周期，共7 d。

验证造模成功的标准：肉眼观察造模后大鼠右踝关节明显红肿、行走缓慢。炎症高峰时可见造模关节较健侧关节红肿明显，皮温升高，骨性标志消失，足爪卷曲、行走迟缓，严重者后肢过度俯曲跛行，甚则表现为三足步态，提示造模成功。

2.4 实验给药

双氯芬酸钠组按成人每日双氯芬酸钠缓释片常用量150 mg，依据人与大鼠的体表面积转换系数，按照成人体重70 kg换算得出每日药物用量为13.39 mg·kg-1；大鼠当归拈痛汤组药量为每日11.25 g·kg-1；空白对照组与模型对照组予0.9%氯化钠溶液灌胃。各组灌胃量均为20 mL/（kg·d）（5 mL）。

2.5 实验取材与检测

2.5.1 一般情况 观察大鼠精神、毛发、行动、饮食、排便、死亡等情况。

2.5.2 关节肿胀度测定 造模前，在大鼠右踝关节上方 0.5 mm 处用记号笔划一条清晰的直线，用自制简易足趾容积测量装置分别于造模前（0 h）、造模后4、8、24、48、72 h测定大鼠关节容积（将10 mL针筒和2.5 mL 针筒相连接，将大鼠右后肢按照划线放入10 mL针筒内，读数，另一侧2.5 mL针筒液面的前后差值即为足趾容积值）。

关节肿胀度＝造模后各时间点关节容积-造模前关节容积。

2.5.3 样本采集 给药结束后所有大鼠禁食12 h，不禁水，随后处死取材，腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉剂量为9 mg·kg-1，腹主动脉取血，血液静置1～2 h，离心15 min（4℃、3500 r·min-1，离心半径15.7 cm），吸取上层血清，分装，-20℃保存。以大鼠受试踝关节为中心，常规备皮、消毒，切取关节囊，分离滑膜组织，保存所需组织。

2.5.4 肝功能、肾功能、IL-1β、IL-13、TNF-α检测 以全自动生化分析仪检测大鼠肝功能[谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）]、肾功能[尿素（UREA）和肌酐（CREA）]水平。按试剂盒说明，常规方法测定大鼠血清中IL-1β、IL-13、TNF-α的浓度。

2.5.5 关节滑膜组织病理学观察 取各组大鼠关节滑膜组织多聚甲醛固定24 h后脱水，依次进行脱水、石蜡包埋、切片，载玻片固定后脱蜡、乙醇梯度脱水、蒸馏水浸洗后苏木素浸染3 min，伊红浸染1 s，脱水烘干后中性树胶封片，于光学显微镜下观察。

2.5.6 关节滑膜组织TLR4、NF-κB-p65蛋白表达检测 提取关节滑膜组织总蛋白，BCA法测定组织蛋白浓度，将所有样本蛋白调整至同一浓度后，100℃使蛋白变性，5 min后放置于冰上冷却，离心取上清液。以每孔10 μL上样，进行电泳，待指示剂到达距凝胶下端约0.5 cm处时取出胶板，并在低温条件下转膜，转膜结束立即取出PVDF膜，放置于5%BSA室温封闭，2 h后，用1×TBST洗膜3次，5 次·min-1。加入抗体TLR4（1∶1000）、NF-κB（1∶1000）、β-actin（1∶2000），4℃孵育过夜，1×TBST清洗3次，5 次·min-1。加入HRP标记的山羊抗鼠二抗（1∶2000），室温孵育2 h，1×TBST清洗5次，15 次·min-1。配制化学发光检测试剂（试剂A∶试剂B＝1∶1）并与膜孵育2 min，曝光显影。以β-actin蛋白表达量进行校正，借助Image J软件分析各蛋白灰度值。

2.6 统计分析

采用 SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料呈正态分布，用平均数±标准差（±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较，若方差齐，采用LSD 法；方差不齐，采用Tamhane’s T2 法。偏态分布资料以中位数（四分位数间距）[M（Q25，Q75）]表示，采用非参数检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 网络药理学研究

3.1.1 当归拈痛汤活性成分及候选靶点的筛选从TCMSP数据库中筛选出来自15种中药的315个活性成分。检索结果表明羌活中活性成分15个，防风中18个、升麻中17个、葛根中4个、白术中7个、当归中2个、党参中21个、甘草中92个、苦参中45个、黄芩中36个、知母中15个、茵陈中13个、猪苓中11个、泽泻中10个、苍术中9个。通过TCMSP数据库检索并删除重复靶点后，共获得253种活性成分的潜在作用靶点。同时，从GeneCards及OMIM数据库中共获得疾病靶点1762个，并将活性成分潜在作用靶点和GA相关靶点均转换成标准基因名。Venn交集处理之后获得两者的共同靶点110个，这些靶点被认为是当归拈痛汤治疗GA的候选靶点。“中药-活性成分-靶点”网络中含有311个节点和1194条边。在该网络中，从活性成分角度来看，甘草异黄酮（licoisoflavone，63343-94-2）、汉黄芩素（wogonin，632-85-9）、磷脂查尔酮（glypallichalcone，146763-58-8）、鳞叶甘草素A（glepidotin A，42193-83-9）、粗毛甘草素C（glyasperin C，142474-53-1）等可能是当归拈痛汤治疗GA的关键活性成分。

3.1.2 当归拈痛汤治疗GA的PPI网络分析为了探究共同靶点之间的互作关系，将其导入STRING数据分析平台，以人为目标物种，生成TSV文件。用Cytoscape 3.6.1软件构建PPI，如图1所示共得到108个有效节点，1867条边，节点越大表明靶点degree值（度值）越高，在PPI网络中，度值较高的蛋白在中心关联中起着重要的作用。以度值大小作为评价指标，获得排名前20的候选靶点，分别是VEGFA、STAT3、PTGS2、PPARG、VCAM1、RELA、MMP9、MYC、NFKBIA、STAT1、SERPINE1、PPARA、MMP2、MTOR、IL-6、NOS3、SELE、JUN、SPP1、MAPK3。

图1 当归拈痛汤治疗GA的蛋白互作网络Fig 1 Protein interaction network of Danggui Niantong decoction for gouty arthritis

3.1.3 高频药物的GO分析和KEGG分析 通过使用R4.1.1数据包对所筛选出的基因列表进行GO富集分析功能，选取P＜0.01的20条通路得到气泡图，见图2。分子功能中排名前3的分别是DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合和RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合。生物过程排名前3的分别是对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应和对营养水平的反应。细胞成分排名前3的是膜筏、膜微区和囊泡腔。

图2 当归拈痛汤治疗GA的GO富集分析Fig 2 GO enrichment analysis of Danggui Niantong decoction in GA treatment

通过KEGG通路富集筛选得到175条信号通路，故选取P＜0.01的30条通路，见图3。经过KEGG通路富集筛选，选取与GA相关的通路，发现疾病相关基因在NF-κB信号通路（NF-κB signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）及TNF信号通路（TNF signalingpathway）上富集的较多。

图3 当归拈痛汤作用靶点的KEGG富集分析Fig 3 KEGG enrichment analysis of the target of Danggui Niantong decoction

3.2 动物实验验证

3.2.1 一般情况 造模前各组大鼠精神良好，反应迅捷，毛发有光泽，饮食排便正常。造模后，除空白对照组外，其余各组大鼠均出现不同程度的右踝关节红肿、足爪卷曲、行走迟缓、跛行，甚至表现为三足步态。模型对照组与给药组大鼠均出现活动量及饮食量减少，体重减轻。模型对照组大鼠出现精神倦怠，反应迟钝，毛发枯槁，大便稀溏；给药组大鼠精神欠佳，皮毛欠光泽，好于模型对照组。实验期间未出现大鼠死亡。

3.2.2 当归拈痛汤对GA大鼠型空关节肿胀度的影响 造模后4 h，模型对照组踝关节肿胀度较空白对照组显著升高（P＜0.01）；造模后8 h，模型对照组较空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），各给药组关节肿胀度均有降低，双氯芬酸钠组较模型对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后模型对照组较空白对照组差异有统计学意义（P＜0.01），给药组关节肿胀度持续降低，造模后48、72 h与模型对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），见表1。

表1 当归拈痛汤对GA大鼠踝关节肿胀度的影响(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

表1 当归拈痛汤对GA大鼠踝关节肿胀度的影响(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

注：与空白对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

组别剂量/（g·kg-1）造模后时间4 h8 h24 h48 h72 h空白对照组0.16±0.040.14±0.040.08±0.050.05±0.050.03±0.04模型对照组0.66±0.10##0.64±0.10##0.57±0.10##0.50±0.09##0.41±0.04##双氯芬酸钠组0.000 670.63±0.070.47±0.09*0.36±0.07**0.28±0.05**0.14±0.04**当归拈痛汤组0.560.67±0.130.50±0.140.46±0.130.38±0.10*0.21±0.05**

3.2.3 当归拈痛汤对GA大鼠血清炎症因子水平的影响 血清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-13在模型对照组中较空白对照组均显著升高（P＜0.01），IL-1β、TNF-α各给药组中均有降低，与模型对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。IL-13给药组较模型差异无统计学意义。具体见表2。

表2 当归拈痛汤对GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影响(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

表2 当归拈痛汤对GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影响(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

注：与空白对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

组别剂量/（g·kg-1）IL-1β/（pg·mL-1）IL-13/（pg·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白对照组24.32±1.39 8.17±0.4368.44±3.10模型对照组31.82±2.10##17.99±1.08##83.21±3.20##双氯芬酸钠组0.000 6725.51±0.82**16.38±1.2367.95±0.89**当归拈痛汤组0.5626.80±1.28**16.34±1.0479.24±1.83*

3.2.4 当归拈痛汤对GA大鼠肝肾功能的影响如表3所示，与空白对照组相比，模型对照组ALT、AST差异无统计学意义；除双氯芬酸钠组ALT较模型对照组下降外，其余各给药组ALT、AST水平与模型对照组相比差异均无统计学意义。提示各组药物未对大鼠肝功能造成不良损害。

表3 当归拈痛汤对GA大鼠ALT、AST的影响(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

表3 当归拈痛汤对GA大鼠ALT、AST的影响(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

注：与模型对照组比较，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

组别剂量/（g·kg-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）空白对照组33.24±1.51137.87±27.18模型对照组34.59±2.40138.33±31.57双氯芬酸钠组0.000 6726.50±4.33*158.02±45.26当归拈痛汤组0.5633.82±4.36103.05±10.60

如表4所示，与空白对照组相比，模型对照组UREA、CREA差异无统计学意义；除双氯芬酸钠组UREA较模型对照组有所下降（P＜0.05），其余各组UREA、CREA与模型对照组相比差异均无统计学意义。提示各组药物未对大鼠肾功能造成不良损害。

表4 当归拈痛汤对GA大鼠UREA、CREA的影响(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

表4 当归拈痛汤对GA大鼠UREA、CREA的影响(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

注：与模型对照组比较，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

CREA/（μmol·L-1）空白对照组6.19±1.0943.61±5.61模型对照组7.03±1.3043.78±6.64双氯芬酸钠组0.000 674.28±0.88*41.01±4.54当归拈痛汤组0.564.95±0.641.08±4.93组别剂量/（g·kg-1）UREA/（mmol·L-1）

3.2.5 当归拈痛汤对GA大鼠踝关节组织病理学的影响 根据大鼠踝关节HE染色结果可知，空白对照组大鼠踝关节滑膜组织的细胞结构完整，层次清晰，无肿胀增生，未见或仅见极少量炎性细胞浸润；模型对照组滑膜细胞增生，局部可见细胞变性坏死，大量炎性细胞浸润。双氯芬酸钠组相比于模型对照组，炎性细胞明显减少，部分滑膜细胞增生，当归拈痛汤组见少量炎性细胞浸润，局部有滑膜轻度增生。见图4。

3.2.6 当归拈痛汤对GA大鼠踝关节滑膜组织中TLR4、NF-κB-p65蛋白表达的影响 由图5～6可知，TLR4蛋白在模型对照组中表达较空白对照组升高（P＜0.01），双氯芬酸钠组、当归拈痛汤组表达较模型对照组降低（P＜0.05，P＜0.01）。NF-κB-p65蛋白在模型对照组中表达较空白对照组升高（P＜0.01），双氯芬酸钠组与当归拈痛汤组表达较模型对照组降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 各组TLR4、NF-κB-p65蛋白表达电泳Fig 5 Electrophoresis of TLR4，NF-κB-p65 protein expression in each group

图6 当归拈痛汤对 GA 大鼠 TLR4/β-actin、NF-κB-P65/β-actin 的影响Fig 6 Effect of Danggui Tiantong decoction on TLR4/β-actin and NFκB-P65/β-actin in GA rats

4 讨论

当归拈痛汤出自《医学启源》，是清热利湿、疏风止痛之名方，方中君药羌活透利关节、防风祛风胜湿止痛；臣药升麻、葛根引阴中之阳上行以解表疏风，白术、苍术燥湿健脾以化湿；方中所用除湿药性偏苦燥，易伤气血津液，故以党参、当归益气养血，并取当归活血散瘀止痛之效，苦参、黄芩、知母、茵陈泄湿热、除烦痛，且知母能防苦燥之药伤阴，祛邪不伤正；猪苓、泽泻淡渗利湿，导其留饮，共为佐药；使药（炙）甘草调和诸药。大量实验与临床研究证明了当归拈痛汤治疗GA的有效性，其能够改善骨损伤和滑膜纤维化、抑制滑膜增生、炎性细胞浸润[8-18]。痛风和高尿酸血症病证结合诊疗指南也指出当归拈痛汤治疗GA的作用已被认可[19]。双氯芬酸钠在临床上使用较为广泛，是治疗GA的首选非甾体类药物，故本实验选用双氯芬酸钠作为阳性对照药物。此次实验中模型大鼠踝关节出现红肿热痛等急性炎症表现，病理组织切片显示的炎性细胞浸润、关节腔赘生物和滑膜增生等，宏观角度证明了当归拈痛汤能减轻大鼠关节肿胀与疼痛，减轻炎性浸润与滑膜增生，初步验证了当归拈痛汤的有效性。

既往对当归拈痛汤治疗GA抗炎有效性的研究很多，但对其机制方面的研究较少。为深入研究当归拈痛汤治疗GA的作用机制，本文采用网络药理学方法筛选出当归拈痛汤治疗GA的315个活性成分、30条通路和110个靶点。基于网络药理学获取的多种活性成分，甘草异黄酮、汉黄芩素、磷脂查尔酮、鳞叶甘草素A、粗毛甘草素C等对应靶点较多，可能是治疗GA的主要活性成分。甘草异黄酮为甘草黄酮中的其中一类，其中以异甘草素为代表。异甘草素能抑制巨噬细胞的极化，下调前列腺素和IL-6的表达[20-21]。痛风患者体内高水平的尿酸钠和炎症因子能够刺激巨噬细胞表面的CD14、TLR4，在细胞内激活IL-1受体相关激酶2（IRAK2），进而上调NF-κB信号，促进巨噬细胞向M1型极化，引起IL-1β、IL-6等促炎因子分泌，且M1型巨噬细胞的过度积聚会加剧炎症反应[22-27]。异甘草素还能抑制TLR4的二聚化，阻滞炎性信号传导而减少炎性因子和炎症介质的合成释放[28]。更有研究发现，异甘草素通过阻止NF-κB抑制因子（IκB）的磷酸化和降解，抑制了TNF-α诱导的中性粒细胞对内皮细胞层的黏附和NF-κB的激活，从而抑制炎症反应。管燕等[29]也从基因与蛋白水平证明了甘草黄酮可降低TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的转录水平并抑制TNF-α的蛋白表达，有明显的抗炎活性；并且验证了甘草查尔酮A对NF-κB活性的抑制作用。汉黄芩素在获取的活性成分中位列第二，其不仅能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，发挥抗炎作用[30-32]，还能抑制炎性因子、黏附分子、趋化因子等聚集于关节滑膜处[33]。有学者认为其机制可能是汉黄芩素在结晶表面形成保护膜从而减少结晶黏附[34]。

基于GO富集与KEGG富集分析筛选出3条重要通路：Toll样受体、NF-κB及TNF信号通路。Toll样受体（TLR）是膜结合受体，在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上表达，TLRs通过诱导促炎细胞因子的产生和共刺激分子的上调来引起先天免疫的快速激活。TLR最常见的为可溶性的TLR4，大量研究表明TLR4/NF-κB信号传导通路在GA的炎症反应中起着重要作用[35]。MSU结晶能直接激活TLR4，其通过MyD88依赖途径可与MyD88相互作用，使活化的MyD88募集下游丝/苏氨酸蛋白激酶IRAKⅠ和IRAKⅡ，随后IRAK4将IRAKI磷酸化并使之分离，分离出的IRAKⅠ与TNF受体相关蛋白6（TRAF6）结合，激活转化生长因子激活性激酶1（TAK1），磷酸化了B细胞k轻肽基因增强子抑制剂（IKK）复合体，从而释放NF-κB，调控下游炎症因子IL-1、lL-6、TNF-α等的释放，介导痛风炎症反应[36]。

TNF也是介导炎症的重要通路，其能诱导巨噬细胞向M1型极化，分泌促炎因子[37]。活化的TNF与其主要受体结合，介导下游NF-κB信号通路的信号传导，以促进炎症反应。此次研究结果显示，TLR4、NF-κB-p65蛋白在模型对照组中表达较空白对照组升高，当归拈痛汤干预后两者表达较模型对照组降低，证明当归拈痛汤能够有效抑制TLR4、NF-κB的信号传导，抑制炎症反应。

基于PPI，筛选并分析发现Rel A（P65）和PTGS2是两个较为重要的靶点。Rel A（P65）亚基是NF-κB家族5个成员之一，NF-κB是其亚基的同源/异源二聚体，NF-κB作为二聚体调节与免疫、炎症相关的基因。NF-κB可由TNF-α、IL-1诱导激活，其依赖于IKK介导的Ser32和36上的NF-kB抑制剂（IκBα）磷酸化和降解的途径，使p50/p65 NF-κB二聚体进入细胞核并激活基因转录，这在炎症反应和细胞凋亡过程中起重要作用。PTGS2即前列素内环氧化物合成酶2（COX-2），是炎症反应的另一重要因素。研究显示，在炎性环境下，关节中的滑膜组织会产生前列腺素，增加COX-2活性，而引起关节疼痛[38]。双氯芬酸钠能抑制环氧化酶活性，从而阻断前列腺素的生成以治疗GA[39]。通过网络药理学预测分析，当归拈痛汤可能也存在与双氯芬酸钠相似的作用机制。

研究显示GA患者会出现血清IL-1β、TNF-α等炎症因子含量升高，滑膜组织不连续，炎性细胞浸润及关节腔赘生物等表现[40-42]。关节炎发作期间，大量中性粒细胞向关节浸润聚集并受MSU晶体激活，随之活化的中性粒细胞与MSU晶体接触产生和释放活化的IL-1β，形成网状沉淀[43-44]；同时也会释放TNF-α、IL-6等进一步激活局部炎症，加剧疼痛[45-47]。在炎性滑膜组织中，MSU向关节软骨表面迁移，侵蚀关节软骨，破坏关节组织。IL-13在GA治疗过程中表现出较强的抗炎活性，能有效下调IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子生成[48-51]。但IL-13与IL-4、IL-10等抗炎因子不同，其在GA急性期表现为低水平，在GA缓解期则处于高水平[52]。本研究采集大鼠样本时已过GA急性发作期，模型对照组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-13显著升高，与GA炎症反应特点一致。证明通过当归拈痛汤的干预，明显减少了GA模型大鼠体内及组织中炎性介质的释放。

有学者对当归拈痛汤干预后的GA模型进行了体重的组间和组内比较，均未发现显著差异，提示当归拈痛汤对体重无明显影响，安全、可行[53]，网络药理学方法筛选出的重要化学成分，甘草异黄酮与汉黄芩素均有护肝的功效[54-56]，本实验结果也证实了当归拈痛汤对GA大鼠模型没有造成肝损伤。

根据网络药理学中通路、靶点以及活性成分的筛选结果，本实验认为当归拈痛汤通过调控TLR4、NF-κB、TNF-α等相关通路，增加抑炎因子IL-13水平，减少TNF-α、IL-1β等炎性因子释放，从而干预GA，且甘草异黄酮、汉黄芩素可能为发挥抗炎作用的关键成分。本研究证明了当归拈痛汤能通过多靶点、多途径实现抗痛风作用，并结合动物实验初步验证了当归拈痛汤干预GA的效果。然而当归拈痛汤中药成分较多且有效物质基础复杂，因此在未来研究中，本课题将继续完善当归拈痛汤的有效成分研究，进一步明确其治疗GA的物质基础。此外，本实验仅从蛋白水平阐明了当归拈痛汤的作用效果，其基因水平是否发生变化还有待验证。