中国不同地区连翘精油成分比较分析

邱智军,原江锋,龚明贵

河南科技大学食品与生物工程学院 河南省食品微生物工程技术研究中心,洛阳 471023

连翘是一种传统大宗药材,是指植物连翘(Forsythiasuspensa)[1]的干果。连翘常用于中医治疗,具有抗菌、抗炎、抗癌等药理功效[2-4]。根据果实的成熟度和采收时间,连翘可分为青翘(green Forsythiae Fructus,GF)和老翘(ripe Forsythiae Fructus,RF)。根据气候条件,GF通常在7月下旬至9月上旬收获,此时果实几乎成熟,但仍呈绿色,大多数GF果实尚未有裂痕。RF通常在10月收获,此时果实完全成熟,呈黄色且开裂。参考《中华人民共和国药典》2020版[5],GF和RF在应用中都被称为连翘。

连翘在中国分布十分广泛。根据连翘资源的历史获取情况,山西、河南和陕西三省分别占总供应量的40%、30%和20%,连翘的资源也分布在安徽和湖北省[6]。连翘多为野生资源,当地人会在合理的时间段(7月下旬至9月上旬)采摘连翘为抢青,这一现象导致市面上的GF数量要高于RF。近些年来,连翘精油受到了相当大的关注[7],Jiao等[8]在连翘中发现了21种精油化合物,精油表现出相对良好的抗菌活性。烯烃、醇和酯是连翘精油中发挥药理作用的主要成分[9,10]。但是,关于连翘生长环境和采收时间差异的影响,尚未对主产区的连翘精油进行定量系统评价,利用GC-MS技术对不同地区的连翘精油成分进行分析仍值得研究,以促进连翘综合利用。

本研究从中国五个省(主要产区)采集了13批连翘,采用GC-MS结合主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)对其精油成分进行了分析和质量评价。其中,基于PCA的质量评价模型用于不同批次连翘的综合质量评估[11],CA则用于不同批次连翘的无监督分类分析[12]。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2018年,共从五个省份采集了13批次连翘(S1～S13),包括9批次GF和4批次RF(见表1)。经河南科技大学园艺与植物保护学院张巧明副教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa的干燥果实。所有材料在室温下在干燥器中避光保存,使用前用粉碎机(40目)粉碎。

表1 样品采集信息

1.2 方法

1.2.1 精油提取

参考《中华人民共和国药典》2020版[5]的挥发油测定法,连翘精油通过水蒸汽蒸馏方法获得。将粉碎后的25 g连翘样品浸泡在300 mL蒸馏水中,使用加热套加热至沸,保持微沸5 h,直到精油体积不再增加,结束加热,获得黄色精油,4 ℃避光保存备用。重复三次,所得精油的产率以百分比(V/W)表示。

1.2.2 GC-MS分析

使用配备DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm;膜厚0.25 μm)的GC/MS-Trace-DSQ系统(Thermo Fisher Scientific,America)分析来自不同地区的连翘精油。流速为1 mL/min的高纯度氦气作为载气。吹扫流速为3.0 mL/min。温度编程如下:从60 ℃(保持2 min)到130 ℃,速率为4 ℃/min,然后从130 ℃到260 ℃(维持20 min),速率为5 ℃/min。进样体积1 μL(分流比1/50),进样口温度250 ℃。MS在220 ℃的界面温度下以电子轰击模式(70 eV)运行;离子源温度为200 ℃,溶剂延迟时间为4 min,质量范围为40～600 amu,扫描速率为6次/s。通过将其质谱与NIST质谱库相匹配,确定了精油的化学成分。单个组分的相对面积(relative area,RA)表示为鉴定化合物的百分比。

1.2.3 统计分析

使用SPSS软件版本25.0进行基于精油化学成分的PCA和CA分析。散点图由Origin 9.0绘制。

2 结果与讨论

2.1 连翘精油产量

来自不同地区的连翘样品的精油产量不同。GF精油的产率范围为1.13%～2.34%,而RF精油的产率在1.42%～1.82%之间(见表2)。其中,S1河南卢氏GF(2.34%)和S13河南卢氏RF(1.82%)的精油产量最高,S9山西太原GF和S11湖北武汉RF(1.13%)的精油产量最低。从药用植物中提取的精油具有广泛的药理应用,如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病和抗衰老功效[13-15]。有报道,来自陕西杨凌的鼠尾草中精油产量在0.91%～1.62%之间[16];红花中精油的产量为1.60%[17]。与这些药材相比,连翘样品的精油产率(1.13%～2.34%)相对较高,值得进一步研究。对于不同地区的药用植物,不同的精油产量被认为与环境条件有关,如降水、温度、太阳辐射、土壤条件和连翘物种的基因型[18];另一方面,对于同一地区的GF和RF,精油产量可能在采收期、发育阶段和连翘物种上表现出差异[19]。

表2 连翘样品精油中的化合物

2.2 连翘精油成分

通过GC-MS鉴定的精油的详细成分在样品中表现出显著的化学多态性。在所有样品提取的精油中总共有54种化合物被鉴定识别,占总成分的比例在80.76%至91.08%之间(见表2)。在这些样品中,烯烃是精油中最丰富的成分,其次是醇类。

随着寻求自然本源疗法的兴起,基于精油的芳香疗法已在国内广泛应用。连翘精油被证明能够通过促进生物活性成分透皮吸收,从而实现缓解外部综合征的功能[2,20]。同时,连翘精油中的化合物还具有诸多用途,比如:用作化妆品香料(3-蒈烯、α-蒎烯和β-蒎烯);镇咳和抑菌(柠檬烯)[21];抗炎和退热(桉叶油醇、绿花白千层醇和香芹酮)[22];抗慢性支气管炎(香叶醇)[16];香水和除臭剂制备(β-月桂烯)[23];医药和肥皂工业(α-松油醇)[24];作为合成维生素E和维生素A的原料(芳樟醇和柠檬醛)[25]。从表2可以看出,α-蒎烯和β-蒎烯是连翘精油的主要成分,占比较高,其他的研究在连翘中也观察到了这种现象[8]。

2.3 主成分分析

对连翘精油中12种常见化合物的主成分分析(PCA)表明,特征值大于1的3个主成分对于总方差的累计贡献率达到77.24%,所以,这3个主成分(PC1、PC2和PC3)被用于综合评价样品的精油成分(见表3)。β-月桂烯、3-蒎烯、α-松油醇、芳樟醇、β-蒎烯和柠檬烯对PC1均有较高的载荷,说明PC1主要反映了这些化合物的信息。另外,绿花白千层醇、α-蒎烷、香芹酮对PC2具有较高的载荷,柠檬醛、香叶醇和桉叶油醇对PC3具有较高的载荷,也可以得出类似的结论。基于PC1和PC2评分的散点图中连翘样品被划分成3个象限组(见图1),第一象限组包括S13、S12、S2、S11和S10,第三象限组只有一个S8,第四象限组包括S1、S3、S9、S7、S6、S5和S4。其中,第一象限组中样品主要是RF(除了S2),第四象限组则都是GF。显然,样品中的GF和RF是不同的,连翘果实中的精油成分受到了收获期和发育程度的很大影响。针对每个样品,PCA计算得到其三个方差贡献率最大的主成分,以它们的成分得分为自变量,其相应的方差贡献率作为权重系数,构建基于线性加权的连翘质量评价函数:H=0.39425*PC1+0.24478*PC2+0.13336*PC3,从而得到它的综合得分H(见表4)。得分越高,评价质量越好[26]。由表4可知,得分最高三个样品分别是湖北武汉RF(S11)、陕西洛南RF(S12)和安徽六安RF(S10)。有研究表明[27],在连翘苷、连翘酯苷A、齐墩果酸、熊果酸、芦丁等诸多活性成分方面,GF要优于RF。然而,对于精油成分而言,如上所述,连翘中RF的综合得分优于GF。Feng等[28]在连翘果精油成分的PCA研究中也发现不同采收时期连翘药材挥发油类成分间存在差异。因此,基于精油成分的观点,可优选RF的开发和利用。

图1 PCA二维散点图

表3 PCA组分矩阵

表4 样品质量评价排序

2.4 聚类分析

聚类分析(CA)是仅基于样品自身特征,依据相似性实现样品聚集的过程[29]。为了研究连翘精油成分与区域之间的相关性,用欧几里得距离测量了样品间的相似度,采用Ward方法对连翘精油中的54种化合物进行了聚类分析。13批样品按CA分成了4类(见图2)。第一类由S4和S5组成,都是GF;第二类由S1、S2、S3、S6、S7、S9组成,也都是GF;第三类包含了S10、S11、S12和S13,都属于RF;S8(山西长治GF)则是一个单独的类别,即第四类。CA能够区分样品中的GF和RF。除S2河南信阳GF外,CA的结果与PCA基本一致。所以,连翘样品中的GF和RF通过12种常见化合物和精油中的54种化合物都能够进行有效区分。

图2 连翘样品聚类分析图

复杂的环境因素会影响精油的理化性质[30],PCA和CA分析中,S8山西长治GF作为单独分类的存在也表明这一点。CA没有识别出更多明确的区域特征,其原因可能是收获期因素对精油理化性质的影响更大。上述结果分析表明,将精油的特征用作连翘收获期和发育阶段的化学分类标记是可行的。

3 结论

本研究以精油成分为研究对象,系统比较分析了不同产地和采收期连翘果实的精油成分组成和含量,结果表明区域环境和采收期两方面因素共同影响着连翘的精油组成状况。本研究提供了连翘精油化学成分变化的初步数据,而连翘精油组成直接决定着其诸多生物活性,因此,为了进一步确定连翘精油组成的变化规律,从而指导连翘精油资源在医疗保健和食品工业领域的开发利用,还需要进行多年采样,在规模更大、采样条件更准确的样本上开展广泛、深入的实验研究。