核桃树叶基质化的酸碱前处理与发酵工艺研究

王应梅， 王艳壮， 李莹杰， 李燕， 何苗， 王晓璟， 杜红斌

（1.塔里木大学园艺与林学学院，南疆设施农业兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.四川省巴中市通江县农业信息服务中心，四川 巴中 636700）

核桃是新疆主导产业之一，种植面积由2003 年 的9.8 万hm2增 至2016 年 的35 万hm2[1]，到2019 年，南疆四地州核桃栽培面积达到38.29 万hm2[2]，栽培面积较大，且仍在持续增长中。同时，核桃叶为羽状复叶，叶面积较大，且数量多，形成了丰富的核桃树叶资源。为防止病虫害等危害，一般都会将核桃落叶清理出园，随后进行焚烧或填埋，既造成了极大的资源浪费，又污染了环境。新疆地处内陆，基质运输成本较高，而将核桃树叶进行发酵腐熟为基质，不仅能解决南疆地区基质需求，降低基质成本，还能促进核桃树叶资源的利用。

堆腐发酵是有机材料基质化的常规方式，在发酵前，通常会采用一定的前处理方式调节材料性质，促进其分解发酵。柴艳芳[3]研究发现，添加松树皮干质量0.4%~0.8%的石灰预处理1 周可以促进松树皮的发酵。郭程程[4]采用硫酸对木耳菌糠进行酸预处理，发现合理浓度的酸预处理有利于菇渣腐熟基质性质的提高。在树叶的处理上，姚文英[5]研究发现，采用2%（体积分数）的草酸浸泡5 mm 粒径树叶0.5 h，其pH 和电导率（electrical conductivity，EC）均有所降低，陈广银等[6]采用不同含量的石灰水喷淋粉碎后过2 cm 筛的树叶，发现采用4.0%（质量分数）石灰预处理效果最佳。植物叶片表面都存在一层蜡质，在一定程度上会阻碍树叶的发酵分解。这层蜡质大多由长链脂肪酸(C>18)及其衍生而来的醛、醇、烷、酮、酯以及一些三萜类化合物和小分子次生代谢产物构成[7]，这些物质大部分可以与酸碱溶液发生反应，由此说明采用酸碱溶液对树叶进行前处理切实可行。在物料的基质化过程中，为促进堆腐发酵过程中微生物活动、调节发酵后基质性质等，通常会添加一些发酵辅助物质，如竹酢液、过磷酸钙、沸石、发酵辅助酶等。张璐[8]研究发现，鼠李糖脂有利于微生物活动，能更好地促进园林废弃物的堆腐发酵。

目前，以树叶为材料开发基质的研究相对较少，将核桃树叶研制为基质的报道更为鲜见，因此本研究通过对核桃树叶进行前处理和堆腐发酵研究，探索核桃树叶基质的研制方法，以期为核桃树叶基质化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及来源

核桃树叶收集于塔里木大学园艺试验站核桃资源圃和新疆阿拉尔市十二团核桃园，采用5 mm筛孔的粉碎机打碎。发酵菌剂为嗜热性侧孢霉（Thermophilic sporotrichum）购自新疆塔克蓝生物科技有限责任公司。玉米粉（用于菌剂扩繁）购自当地粮油超市。发酵添加剂为鼠李糖脂（棕色液体，纯度80%，质量浓度60 g·L-1），购自西安瑞捷生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃树叶酸碱前处理 分别设置体积分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% 的草酸（C1~C6）和体积分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的氨水（N1~N6）处理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h（H1~H5），即酸碱处理各30个。

核桃树叶前处理方法：将粉碎的核桃树叶放入大水桶中，加等体积自来水浸泡1 d后捞出控水（不滴水）[9]；然后分别加入等体积的不同处理溶液，按照预设时长进行处理；最后控干处理液，用等体积自来水漂洗干净，烘干后用于核桃树叶理化性质的测定。

1.2.2 核桃树叶堆腐发酵 核桃树叶堆腐发酵试验于2021 年6—8 月在新疆阿拉尔市十团果色甜香果蔬农民专业合作社进行。试验共设置9 个处理，详见表1。鼠李糖脂添加量以粉碎后的干核桃树叶质量计算。将进行氨水前处理的核桃树叶（A 组）与未进行氨水前处理的核桃树叶（B 组）分别建堆，堆体呈近圆锥形，高约0.8 m，直径约1.6 m。将发酵菌剂（菌剂添加量为0.1%，以粉碎后的干核桃树叶质量计算）与玉米粉混合，按量取鼠李糖脂融入水中稀释，翻拌时均匀洒入菌剂并喷淋稀释的鼠李糖脂溶液，使核桃树叶、菌剂、鼠李糖脂混合均匀，最后控制堆体湿度在60%左右，覆膜发酵。每天测定发酵堆和外界的温度，适时翻堆，补充水分。每次翻堆混匀后取样，用于测定核桃树叶发酵过程中碳氮质量比（C/N）、pH、电导率（electrical conductivity，EC）及胡敏酸（humic acid，HA）、富里酸含量（fulvic acid，FA）。发酵结束后，取样检测基质重金属及潜在毒害元素钠（Na）、氯（Cl）含量，并进行种子发芽试验，检验基质安全性。

表1 核桃树叶发酵处理Table 1 Walnut leaves fermentation treatments

1.3 测定指标及方法

1.3.1 容重、孔隙度、pH、EC 值和发酵温度的测定 参照王应梅等[10]的方法测定容重、孔隙度、pH 和EC。采用北京凯安达仪器仪表有限公司生产的多通道温度测定仪和电阻式电子数显温度计测定发酵温度，分别于每日10:00 和20:00 测定发酵堆体温度和环境温度。

1.3.2 胡敏酸、富里酸、有机碳、全氮、重金属和潜在毒害元素含量测定 胡敏酸（HA）、富里酸（FA）、全氮、重金属和潜在毒害元素（钠、氯）含量送样于南京瑞源生物技术有限公司进行测定。有机碳含量参照标准HJ 761—2015[11]，采用灼烧减量法测定。有机碳含量和全氮含量的比值即为C/N。

1.3.3 种子发芽指数的测定 种子发芽指数（germination index，GI）参考白永娟[12]的方法，取风干样5 g，加100 mL 蒸馏水在37 ℃条件下震荡提取30 mim，过滤后取 9 mL滤液于铺有滤纸的培养皿中，加入30 粒小白菜种子，放入25 ℃恒温培养箱中培养24 h，统计发芽率并测定胚根长，以蒸馏水处理作为对照，每个处理重复6次。

1.4 数据整理与分析

采用Microsoft Office Excel 2019 进行试验数据的整理与图表制作，采用DPS7.05 对数据进行方差分析。通过灰色关联度法对不同酸碱前处理后核桃树叶理化指标进行综合分析排序。灰色关联度分析依据邓聚龙[13]提出的灰色系统理论原理，将30 个草酸前处理的7 个核桃树叶理化指标看成同一个灰色系统，30 个氨水前处理的7 个核桃树叶理化指标看成另一个灰色系统，每个处理方法或理化指标为该系统中的1 个因素，参考杨泽敏等[14]的方法计算系统中各因素间的联系程度。理想处理方法的设定综合考虑蔬菜育苗基质标准[15]要求及有机物质发酵微生物生长适宜酸碱条件，分别取容重、气水的体积比、pH、总孔隙度、通气孔隙度和持水孔隙度最大值和EC 最小值够成理想处理，采用变异系数法确定权重。

2 结果与分析

2.1 核桃树叶酸碱前处理条件探究

2.1.1 酸溶液前处理条件探究 根据灰色关联度分析原理，关联度大的处理与理想处理接近程度大。由表2可知，等权关联度排序前3位的草酸处理分别为C2H1、C2H2、C1H5；计算加权关联度后，排序结果前3 位仍为C2H1、C2H2、C1H5处理，加权关联度最大，同样为C2H1处理。由此说明C2H1处理的综合理化性质最好，即核桃树叶采用1%草酸溶液处理0.5 h较为适宜。

表2 不同前处理核桃树叶理化指标灰色关联度排序Table 2 Ranking of correlation degree on physical and chemical indexes of walnut leaves treated by different pretreatment

2.1.2 碱溶液前处理条件探究 从表3 中可以看出， N3H2处理的等权关联度最大，N1H4处理加权关联度最大。但前处理对核桃树叶各个理化指标的影响程度不同，需要根据加权排序结果筛选最佳处理，因此氨水处理核桃树叶采用0.5%溶液处理2 h较好（N1H4）。

表3 不同水平氨水溶液及时长处理核桃树叶理化指标灰色关联度Table 3 Correlation degree of physical and chemical indexes of walnut leaves treated by different concentration of hartshorn and different duration

2.1.3 酸、碱溶液前处理对比 由灰色关联度分析筛选得出草酸适宜前处理条件为1%溶液处理0.5 h；氨水适宜前处理条件为0.5%溶液处理2 h。对比草酸和氨水最优处理条件下核桃树叶的理化性质（表4）发现，容重、孔隙度、EC等差异较小，而氨水处理后的pH 为6.61，草酸处理后的pH 为3.09。由于嗜热性侧孢霉的适宜pH 为4~8[16]，因此，氨水处理后的pH 更为适宜核桃树叶发酵，0.5%氨水处理2 h为核桃叶前处理的最优选择。

表4 草酸、氨水最优处理条件下核桃树叶理化性质Table 4 Physicochemical properties of walnut leaves treated with oxalic acid and ammonia

2.2 核桃树叶堆腐发酵

2.2.1 发酵过程中堆体温度变化 由图1 可知，发酵过程中堆体温度明显高于外界气温。上午堆体温度为32.85~54.25 ℃，下午为35.63~62.28 ℃，最高温度达62.28 ℃。建堆发酵后，堆体温度快速上升，2 d后温度达到最高，而后由于氧气的消耗，温度逐渐降低，7 月5 日翻堆后温度又开始上升。除翻堆使温度变化较大外，气温对发酵堆体温度的影响也较大，7月12日—23日和8月14日—16日多阴雨天气，因此堆体温度相对较低。前期堆体的温度变化相对滞后于气温变化，后期与气温变化同步。在9个发酵处理中，A3处理温度最高，B9处理温度最低；且A 组处理温度略高于B 组处理，说明经过氨水前处理后添加0.3%的鼠李糖脂（A3）有利于核桃树叶发酵堆体温度的提高。

图1 不同发酵处理堆体温度及气温变化Fig. 1 Changes of heap temperature and temperature under different fermentation treatments

2.2.2 发酵过程中堆体pH、电导率变化 由图2可知，堆体pH随着发酵时间的延长逐渐升高，前期各处理的上升速度存在差异，但发酵结束时pH均为8.0左右，说明是否进行氨水前处理和添加鼠李糖脂对核桃树叶堆腐后pH影响较小。对于进行过氨水前处理的A 组，其堆体电导率（EC）在发酵第1周迅速降低，而在随后发酵过程中基本稳定不变，不同鼠李糖脂添加量处理间差异较小，说明氨水前处理有利于堆体EC的降低；而经过氨水处理后，鼠李糖脂对核桃树叶发酵过程中堆体EC 的影响较小。对于未进行前处理的B 组，其堆体EC 随着发酵时间的延长呈上升趋势，其中B9处理上升较快；B3处理上升较慢，且EC始终低于B0处理，说明添加质量分数为0.3%的鼠李糖脂有利于缓解未进行氨水前处理核桃树叶发酵过程中EC值的上升。

图2 不同发酵处理的pH和电导率Fig. 2 pH and electrical conductivity under different fermentation treatments

2.2.3 不同发酵处理核桃树叶腐殖情况 由图3可知，胡敏酸（HA）含量从发酵初始至第5 周呈下降趋势，第5 周至第7 周呈上升趋势。发酵前期HA 含量降低可能是由于核桃树叶中本身存在的HA 含量较高，且不稳定；发酵过程中将原本存在的HA 分解，重新合成了分子量较大、结构更为稳定的HA。在发酵过程中，A 组处理堆体的HA 含量始终低于B 组，可能是由于HA 可溶于碱性溶液，因而A 组受氨水前处理的影响HA含量较低。在发酵初始，堆体富里酸（FA）含量较高；发酵1 周后FA 含量快速降低，而后基本保持稳定，各处理间没有明显的规律性差异。FA是活跃的小分子有机酸，能被微生物利用，发酵初期微生物大量增值，消耗掉较多FA；发酵中后期堆体中存在有机物分解释放和微生物的消耗及FA 向HA 的转化，即产生与利用达到平衡，使HA 含量基本稳定。E4/E6 值是表征HA 分子大小与聚合程度的指标。由图4 可知，A0~A9 处理的E4/E6 值在第1 周快速下降，而后呈缓慢上升趋势；B0~B9 处理的E4/E6 值下降上升波动变化，较不稳定；且A0~A9 处理的E4/E6 值始终低于B0~B9 处理。

图3 核桃树叶发酵过程中胡敏酸、富里酸和E4/E6值变化Fig. 3 Changes in HA， FA， and E4 / E6 values during the fermentation of walnut leaves

图4 不同发酵处理的C/N变化和T值Fig. 4 C/N and Tvalue under different fermentation treatments

2.2.4 不同发酵处理C/N 变化及T值差异 由图4 可知，在核桃树叶发酵过程中，堆体C/N 呈下降趋势。其中B0~B9处理缓慢下降，除B6处理在发酵中期C/N 较高外，其余3个处理的C/N 均低于B0 对照，说明添加鼠李糖脂利于核桃树叶发酵堆体C/N 的降低；A0~A9 处理在第1 周时下降快速，随后缓慢降低，不同鼠李糖脂添加量处理间差异较小。发酵结束后，A0~A9 处理堆体的C/N 均低于B0~B9 处理，说明氨水前处理有利于核桃树叶发酵过程中C/N 的降低，可以促进核桃树叶的发酵分解。T值是发酵结束时的C/N 与初始物料的C/N 之比，由图5 可知，B0 处理的T值最高，为0.58；A3 处理最低，为0.36。进行氨水前处理的A组堆体T值显著低于未进行前处理的B 组；在同组内不同鼠李糖脂添加量处理间差异较小。

图5 不同发酵处理核桃树叶基质浸提液种子发芽指数Fig. 5 Seed germination index of substrate extracts under different fermentation treatments

2.2.5 不同发酵处理核桃树叶基质安全性分析 国标GB/T 33891—2017 绿化用有机基质[17]对潜在毒害元素和重金属含量进行规定，钠离子含量小于1 000 mg·L-1，氯离子含量小于1 500 mg·L-1；园艺用基质重金属含量应该达到标准Ⅰ级要求。由表5 可知，不同处理条件下发酵结束后核桃树叶基质的重金属和潜在毒害元素含量均符合要求。

表5 不同发酵处理核桃树叶基质重金属和潜在毒害元素含量Table 5 Contents of heavy metals and potentially toxic elements in walnut leaf substrate

种子发芽指数是检测基质安全性和腐熟度最为直观有效的方法。当种子发芽指数大于50%时，认为基质基本腐熟；大于80%认为基质完全腐熟[18]。由图5 可知，B0 处理的发芽指数为70.56%，大于50%，基本达到腐熟；其余基质的发芽指数均达到80%以上，即基质完全腐熟。由此表明，所有处理基质均安全可用。

3 讨论

酸碱前处理是调节核桃树叶理化性质、促进其分解发酵的一种手段。本研究结合基质理化指标要求、基质原始材料在发酵过程中的变化[19-21]和基质原始材料发酵条件，分别取酸碱前处理后核桃树叶的容重、气水体积比和pH均值和总孔隙度、通气孔隙度和持水孔隙度最大值及EC最小值构成理想处理，创新地采用了灰色关联度法分别筛选酸碱溶液的适宜处理水平与处理时长组合，降低了数据分析的难度，同时使处理后的核桃树叶更适宜后期发酵。通过灰色关联法筛选出的草酸适宜前处理条件为体积分数1%溶液处理0.5 h；氨水的适宜前处理条件为体积分数0.5%溶液处理2 h。对比草酸和氨水各自适宜处理条件下核桃树叶的理化性质，发现氨水处理后的pH更适宜核桃树叶发酵，因此，确定体积分数0.5%氨水处理2 h为适宜的核桃树叶前处理条件。

在物料堆腐发酵过程中，温度是监测发酵情况的重要指标，陈汉才等[22]认为，发酵堆体温度在55 ℃条件下保持3 d以上或50 ℃以上保持5~7 d，可以有效杀灭物料中的致病微生物，确保堆肥卫生指标合格。本研究发现，在6月28日至7月3日发酵堆体的温度都在50 ℃以上，且保持高温6 d，达到高温要求，卫生指标合格。堆体温度变化受到外界温度的影响，但前期（6 月28 日—8 月16 日）堆体温度的变化相对滞后于气温的变化；后期与气温变化同步，说明前期堆体快速发酵产热，而后期产热较少，表明核桃树叶基本发酵腐熟。在发酵过程中，堆体pH随发酵时间的延长逐渐升高，这可能与发酵过程中碱性物质的生成有关； A0~A9 处理的电导率呈降低趋势，而B0~B9处理的电导率呈上升趋势，说明氨水前处理有利于控制堆体电导率的升高。

在有机物料发酵分解过程中，有机质大分子在堆肥前期降解为小分子物质,然后被微生物矿化为CO2排放到空气中,或在堆肥后期通过特定途径聚合形成腐殖质[23]。腐殖质主要包含胡敏酸(HA)和富里酸(FA),其中HA 为大分子复合物,相对稳定；而FA 分子量较小,活性较高,可被微生物分解利用[24]。研究表明，在鸡粪+稻草发酵过程中，FA 呈下降趋势，HA 在堆肥初期迅速下降后期缓慢上升[25]；在新鲜牛粪+甘蔗渣[26]与鸡粪+蔬菜废弃物[27]发酵过程中，HA含量稳步上升，FA含量逐步下降；在餐厨垃圾+水稻秸秆发酵过程中，FA先增加后降低，HA 的含量快速上升[28]。本研究发现在核桃树叶发酵过程中HA 和FA 含量都在降低，结果与前人研究结果存在差异。这一方面是因为核桃树叶材料本身偏酸性；另一方面与氨水前处理有关。吴阳等[29]研究表明，园林绿化废弃物堆肥在发酵过程中E4/E6 值上升；吴梦婷等[30]进行牛粪秸秆混合堆肥发现，E4/E6 值呈先升高再降低的趋势。本研究表明，A0~A9 处理的E4/E6 值在第1 周快速下降，后又缓慢上升；B0~B9 处理的E4/E6 值呈下降上升波动变化。发酵初始时E4/E6 值较高，说明初始时HA 分子较小，聚合度较低；发酵后E4/E6值有所下降，且A0~A9处理始终低于B0~B9 处理，说明氨水前处理有利于大分子HA 的生成，提高了HA 的聚合度；发酵结束时，E4/E6 值仍然较高，说明腐殖酸分子仍相对活跃。核桃树叶腐殖酸和E4/E6 值在发酵过程中变化较大且规律不稳定，因而不宜用作判断核桃树叶腐熟的评价标准，与前人研究结果一致[31-32]。Morel等[33]提出用T值来判别堆肥的腐熟程度，当T值小于0.6 时可认为堆肥腐熟。本研究发现8 个发酵处理的T值为0.36~0.58，均小于0.6，表明所有处理核桃树叶均发酵腐熟。在发酵所得基质安全指标上，本研究所有处理的重金属含量都在安全范围内，且种子发芽率除B0 处理为70.56%外其余处理都高于80%，远超过50%，说明所有处理核桃树叶基质都安全可用。

在核桃树叶堆腐发酵部分，除却分析后发现不适宜用作评价指标的HA、FA、E4/E6值外，温度、T值、重金属含量和基质浸提液种子发芽指数等指标都表明8个处理的核桃树叶发酵腐熟，且所得基质安全可用，其中A3处理发酵过程中保持相对较高的温度，T值最低，发芽指数在85%以上，堆腐效果优于其他处理。结合前期的酸碱前处理，表明核桃树叶基质研制的关键工艺为体积分数0.5%的氨水处理2 h后添加质量分数为0.3%鼠李糖脂进行发酵，完整的基质化工艺流程如图6所示。

图6 核桃树叶基质化工艺流程Fig. 6 Substrate process of walnut leaves

核桃树叶基质化是将其转化为可在田间应用的基质的过程。本研究仅对核桃树叶的酸碱前处理和堆腐发酵进行了研究，后续工作仍需在两方面继续努力：一是核桃树叶基质的应用实践，本研究结果表明核桃树叶基质安全可用，但实际的应用效果如何，在育苗应用上能否培育壮苗，在栽培应用上能否保证作物生长和产量，这些都需要进一步检验；二是本研究虽筛选出了适宜的核桃树叶前处理条件，但处理后核桃树叶结构的变化机理却未知，应进一步通过显微观察、叶表蜡质含量测定等方法探究核桃树叶片结构与物质组成在前处理后的变化，或可取得新的发现。