土壤微生物多样性对有机碳源物料输入的响应特征

申云鑫， 施竹凤， 韩天华， 周旭东， 贺彪， 赵文山，和强， 马斌， 陈齐斌， 杨佩文2

（1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201； 2.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205；3.云南省烟草公司丽江市公司，云南 丽江 674100）

施用动物类粪便是农业生产的主要措施之一，对土壤质量、可持续利用以及作物生长发育具有深远影响，长期配施动物类粪便可改善土壤理化性质，进而影响作物的健康与产量[1]。研究表明，动物类粪便能改善土壤农化性状，提升土壤肥力，并且对土壤养分具有缓释效果[2-3]。作为我国农业生产中的主要肥源之一，一方面，动物类粪便含有多种可被作物吸收利用的微量元素、活性酶以及有机质等，在保持、改善和提高土壤肥力、活化土壤养分，进而促进农作物高产、优质以及降低农产品生产成本等方面有着不可替代的作用[4-5]；另一方面，土壤微生物在维持土壤系统的稳定和可持续生产中占主导地位，其群落结构和丰度与施肥方式息息相关，可通过一系列复杂的生物化学反应分解动物类粪便中的有机物质，释放有效态养分形成腐殖质，同化土壤碳素并固定无机成分形成其生物量，对提高土壤肥力和促进作物生长具有重要作用[6-7]。

土壤微生物群落的结构组成受施肥方式、作物管理措施和土壤环境等因素的影响，不同的作物类型、管理措施、土壤环境及长期施肥方式等对其影响差异很大[8-9]。国内外关于动物类粪便及动物类粪便配施无机肥的研究表明，施用动物类粪便在增加粮食作物产量的同时可以提升其品质[10]。施用动物类粪便可平衡土壤矿质营养，提高土壤肥力、改善其理化性质、优化土壤微生物群落以及增强微生物活性，而在不施肥或单施化肥的情况下效果不明显[11-13]。动物类粪便配施对作物吸收与利用营养物质也具有促进作用，较单施无机肥更能促进微生物生长，可更大程度提高微生物生物量和碳源利用率[14-15]。因此，可结合化肥肥效快、肥力强、能短期内提供作物生长营养物质，有机肥养分丰富、含量均衡和肥效持久等优点，应用动物类粪便配施无机肥技术，改善土壤环境、增加土壤有益细菌数量、促进有益菌的生长、提高土壤酶活性等，进而提高土壤肥力、作物品质和产量[16-18]。

土壤微生物群落结构在不同的气候、土壤和作物条件、不同动物类粪便及其施用方式下均有差异，因此需要针对不同条件合理应用施肥措施，本文运用对同类研究结果进行定量评估的Meta分析方法[19-20]，以不施肥和单施无机肥作为动物类粪便施用的对照，通过收集现有文献的相关田间试验数据，探究不同条件下施用动物类粪便后土壤微生物多样性的差异与变化特征，明确作物根际土壤细菌多样性差异的主要影响因素，以期为因地制宜合理施用动物类粪便或配施无机肥技术的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

通过Web of Science、Springer、中国知网（CNKI）、万方、维普、Google Scholar 等中英文数据库分别输入“有机肥（organic fertilizer）”“牛粪（cow manure）”“猪粪（pig manure）”“鸡粪（chicken manure）”“羊粪（sheep manure）”等和“微生物多样性（diversity and microbe/microbial community/microbial diversity/morphological diversity/metabolic diversity）”“ 中 国（China）”等，所选文章基于以下标准：①试验区域选择中国地区；②对照包含单施无机肥（inorganic fertilizer，IF）和不施肥（no fertilizer，NF）、试验组分为单施动物类粪便（animal measure，OM）、无机肥+动物类粪便（IF+OM）措施中的1 种或多种；③研究地点的背景条件、研究方法明确；④相同的试验数据发表在不同期刊时，选择信息描述较为全面的文献。

通过EndNote 剔除试验地点、试验年份、作物类型和试验数据结果相同的文献，共有54 篇文献符合筛选标准，纳入Meta 分析。选择目前研究土壤微生物多样性和丰富度最为广泛和最具代表性的2 个数量指标：Shannon 多样性指数（描述群落多样性的高低）和Chao l丰富度指数（描述物种总数的大小）作为探究指标。对于数据库中的每项研究，还搜集了相关的试验地点、气候因素（年平均温度和降水量）和有机肥类型以及施肥措施等数据。数据来自各项纳入研究的表格和图，当数据以图的形式呈现时，通过Web Plot Digitizer软件提取。若文献直接报告了标准差或者根据标准误和样本量计算标准差，文章未给出标准差或者无法计算的时候，以平均值的10%作为标准差（文中所提取的大部分数据的标准差均符合10%的计算标准，且原始数据的标准差始终低于平均值的10%）[21]。因为Meta分析的一个假设为所有研究之间相互独立，故提取过程中如遇不同时期测定多个数据的研究，仅取采样日最近的数据[22]。

1.2 数据分类

根据文献中动物类粪便的施用方法，对筛选的数据进行分类，试验组为施用动物类粪便组（application animal manure，AM），包括单施动物类粪便（OM）和动物类粪便配施无机肥（OM+IF），对照组分为不施肥组（NF）和单施无机肥组（IF），共收集120组细菌Shannon指数配对试验数据，其中OM vs NF 共37组，OM vs IF 共45组，OM+IF vs NF共17 组，OM+IF vs IF 共21 组；共收集90 组Chao l指数配对试验数据，其中OM vs NF 共26 组，OM vs IF 共30 组，OM+IF vs NF 共16 组，OM+IF vs IF共18 组。此外，至少纳入10 组数据进行分组研究，若分组数据n<10，则各数据应分别来自完全相互独立的3个或3个以上研究[23]。

1.3 统计分析

对动物类粪便施用下土壤细菌多样性进行Meta分析，若文献只提供标准误，标准差（standard deviation, SD）使用公式（1）计算。

式中，SE为标准误，n为重复数。

利用各研究中对照组的平均数（Xc）的对数值与处理组的平均数（Xt）的对数值之间的差值来计算对数响应比（lnR++），公式如下。

计算95% 的置信区间（95% confidence interval, 95% CI），如果95%置信区间包含0，则处理组与对照组差异不显著；若不包含0，即差异显著（P<0.05）[24]。

将分析结果转化为相对变化率（Y），可更加直观解释土壤细菌多样性对动物类粪便施用的响应特征，使用公式（3）[25]进行计算。

异质性检验及发表偏倚检验：通过使用Q统计量进行异质性检验，Q服从于自由度为k-1的卡方分布，当异质性检验结果显著时（P<0.05）表明研究间存在异质性，故选择随机效应模型，反之选择固定效应模型。此外，本研究利用失安全系数法（rosenthal’s method）进行文献的发表偏倚检验，若潜在值大于临界值即不存在发表偏倚[25]。

1.4 数据处理

使用Web Plot Digitizer和Microsoft office 2010进行数据收集提取和数据集建立，以及常规的数据计算；利用Metawin 2.1 进行Meta 分析[26]，确定动物类粪便施用是否对细菌多样性有显著影响。此外，利用 Sigmaplot 14.0软件进行森林图绘制。

2 结果与分析

2.1 动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数数据异质性检验及发表偏倚检验分析

对动物类粪便施用对土壤细菌多样性指数的异质性检验及正态性检验结果如表1 所示，与动物类粪便施用相比，不施肥和单施无机肥处理异质性检验均有显著差异（P<0.05），故采用随机效应模型，对Shannon多样性指数和Chao l丰富度指数分组数据进行发表偏倚检验，各分组潜在效应值均大于临界值，表明各组合数据间均不存在发表偏倚。

表1 施用动物类粪便对 Shannon 和 Chao l 指数数据的异质性及正态性检验Table 1 Heterogeneity and normality test of Shannon and Chao l index after application of animal manure

2.2 不同动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

施用动物类粪便对土壤细菌Shannon 多样性指数和Chao l 丰富度指数具有不同程度的影响（图1）。相较于不施肥，施用鸡粪、牛粪、猪粪可显著促进土壤细菌Shannon 多样性指数（P<0.05）；其中牛粪的促进作用最为显著，达29.15% (95% CI：12.14%～48.74%)；其次为鸡粪，促进效果达16.25% (95% CI：11.52%～21.18%)；猪粪的促进作用略低，为6.41% (95%CI：2.27%～10.69%)。同时，鸡粪、牛粪、猪粪的施用对Chao l丰富度指数也呈显著正效应（P<0.05），鸡粪的促进效果达9.34% (95% CI:3.95%～15.00%)，牛粪的为7.59% (95% CI: 4.64%～10.64%)，猪粪 的为5.30% (95% CI:0.21%～10.63%)。

图1 施用不同动物类粪便对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 1 Effect of manure application on soil bacterial diversity index

相较于单施无机肥，鸡粪、牛粪、猪粪对土壤细菌Shannon 多样性指数也具有显著促进作用（P<0.05）。其中，牛粪的促进效果最强，达40.97% (95% CI: 21.53%～63.53%)；其次为鸡粪，促进效果达23.09% (95% CI: 9.58%～38.02%)；猪粪次之，为4.91% (95% CI:3.10%～6.73%)；且鸡粪、牛粪、猪粪的施用对Chao l丰富度指数的正效应显著（P<0.05），鸡粪的相对变化率为5.17%(95% CI: 0.56%～10.00%)，牛粪的为2.72% (95%CI: 0.12%～5.39%)，猪 粪 的 为5.52% (95% CI:2.75%～8.35%)。综上可知，与不施肥或单施无机肥相比，鸡粪、牛粪、猪粪的施用均可显著提高土壤微生物多样性指数，对构建高微生物群落多样性土壤起着显著的促进作用。

2.3 不同作物类型下动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

由于部分对照组数据量较少，本小节将不施肥与单施无机肥合并为不施动物类粪便组作为对照。由图2 可知，不同作物类型对动物类粪便施用的响应特征不同，茄科、豆科、禾本科、蔷薇科及葫芦科根际土壤细菌Shannon多样性指数和Chao l丰富度指数对动物类粪便的施用的响应均呈显著正向效应（P<0.05），其中，茄科作物根际土壤细菌Shannon多样性指数和Chao l丰富度指数的提高最显著，分别提高了43.78% (95% CI:29.78%～59.27%)、6.39% (95% CI: 1.46%～11.55%)；就Shannon 多样性指数而言，豆科、禾本科、葫芦科、蔷薇科的增加率依次分别为：35.84% (95% CI:28.97%～43.08%)、9.06% (95% CI:7.18%~10.97%)、8.22% (95% CI:4.52%~12.07%)、6.34% (95% CI:0.61%~12.39%)；就Chao l 丰富度指数而言，蔷薇科、豆科、禾本科、葫芦科的增加率依次增高，分别为3.41% (95% CI:1.31%~5.54%)、4.79% (95% CI:2.26%~7.40%)、5.79% (95% CI: 3.54%~8.09%)、6.15% (95% CI:0.84%~11.74%)；但芭蕉科作物根际土壤细菌Shannon 多样性指数和Chao l 丰富度指数对动物类粪便的响应均不显著。

图2 不同作物类型下施用动物粪便对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 2 Effects of animal manure application on soil bacterial diversity index under different crop types

2.4 不同施肥方式下动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

不同施肥方式下，施用动物类粪便对土壤细菌Shannon 多样性指数和Chao l 丰富度指数影响结果表明（图3），相较于不施肥（NF）和单施无机肥（IF），动物类粪便的2种施肥方式（OM、OM+IF）均可显著增加土壤细菌Shannon 多样性指数（P<0.05），与不施肥相比，单施动物类粪便（OM）增加24.14% (95% CI: 13.42%~35.84%)，动物类粪便配施无机肥（OM+IF）增加7.57% (95% CI:4.64%~10.57%)；动物类粪便不同施用方式对Chao l 丰富度指数的正向效应较低，单施动物类粪便Chao l 丰富度指数提高8.19% (95% CI:6.99%~9.38%)，动物类粪便配施无机肥提高4.44% (95% CI: 3.15%~5.72%)。

图3 不同动物粪便施用方式对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 3 Effects of different manure application methods on soil bacterial diversity index

与单施无机肥相比，单施动物类粪便（OM）细菌Shannon 多样性指数提高26.03% (95% CI:16.37%~36.51%)，动物类粪便配施无机肥（OM+IF）使其增加7.01% (95% CI: 4.35%~9.75%)；Chao l 丰富度指数的增加略低，OM 和OM+IF 分别使其增加4.79% (95% CI:3.78%~5.80%)、2.99% (95%CI: 1.57%~4.42%)。以上结果表明，单施动物类粪便（OM）对土壤细菌多样性指数的促进作用最为显著，增加效应超过动物类粪便配施无机肥（OM+IF）的2~4倍。

2.5 不同区域下动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

基于不同区域分析（图4），相较于不施肥，施用动物类粪便对西北地区、南方地区及北方地区土壤细菌Shannon 多样性指数均具有显著促进作用（P<0.05），其中，西北地区促进作用最强，为96.68% (95% CI: 58.88%~143.47%)，其次为南方地区及北方地区，增加率分别为17.87% (95% CI:6.37%~30.59%)、7.81% (95% CI: 5.72%~9.93%)；不同区域施用动物类粪便对Chao l 丰富度指数的影响效果不同，南方地区的增加率为6.97% (95% CI:4.34%~9.67%)，北方地区的增加率为6.66% (95%CI: 2.96%~10.49%)，西北地区的促进效果不显著。

图4 不同区域施用动物粪便对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 4 Effects of animal manure application on soil bacterial diversity index in different areas

相较于单施无机肥，南方地区和北方地区土壤细菌Shannon 多样性指数均呈现显著促进作用（P<0.05），其中，南方地区的增加率最高，达29.19% (95% CI: 18.34%~41.03%)，北 方 地 区 次之，增加率为13.43% (95% CI: 8.72%~18.33%)，西北地区的增加效果不显著；施用动物类粪便后不同区域Chao l 丰富度指数的响应特征不同，南方地区的促进效果为4.51% (95% CI:1.22%~7.91%)，北方地区的促进效果为4.29% (95% CI:2.44%~6.17%)，而在西北地区不具显著性。

2.6 不同年降水量下动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

基于不同年均降水量分析（图5），相较于不施肥，在降水量少于1 500 mm 时，施用动物类粪便对土壤细菌Shannon 多样性指数均具有显著促进作用（P<0.05），降水量≤500 mm 和降水量为500~1 500 mm 时土壤细菌Shannon 多样性指数分别 增 加 17.14% (95% CI: 9.44%~25.41%) 和24.62% (95% CI:16.81%~32.95%)。年均降水量少于1 500 mm 对Chao l 丰富度指数也呈显著正效应，降水量≤500 mm 和降水量为500~1 500 mm 时分别增加6.42% (95% CI: 1.95%~1.09%)和7.94%(95% CI: 4.67%~11.32%)。

图5 不同降水量下施用动物粪便对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 5 effect of animal manure application on soil bacterial diversity index under different precipitation

相较于单施无机肥，在降水量大于500 mm时，施用动物类粪便对土壤细菌Shannon 多样性指数均具有显著促进作用（P<0.05），降水量为500~1 500 mm和降水量≥1 500 mm时分别增加30.34%(95% CI:22.64%～38.53%)和7.75% (95% CI:4.02%~11.61%)。Chao l 丰富度指数对降水量的响应特征表明，在降水量大于500 mm 时对土壤细菌Chao l丰富度指数具有显著促进作用（P<0.05），降水量≥1 500 mm 时增加3.45% (95% CI: 1.46%~5.46%)，降水量500~1 500 mm 时增加5.99% (95% CI:1.84%~10.33%)，当降水量≤500 mm时促进效果不显著。

2.7 不同年均温度下动物类粪便施用对土壤细菌多样性和丰富度指数的影响

基于不同年均温度分析（图6），施用动物类粪便对土壤细菌Shannon 多样性指数均具有显著促进作用（P<0.05），相较于不施肥，土壤细菌Shannon 多样性指数的增加率随着年均温度的升高而降低，在年均温度≤5 ℃时，正效应最显著，增加了26.39% (95% CI: 8.29%~47.52%)，其次为年均温度5~15 ℃和≥15℃，分别增加24.62% (95% CI:15.65%~34.29%)、7.85% (95% CI: 3.60%~12.28%)。当年均温度≤5℃时，土壤细菌Chao l 丰富度指数增加5.32% (95% CI:4.81%～5.82%)，年均温度5~15 ℃ 时增加8.88% (95% CI: 4.93%～12.98%)，年均温度≥15 ℃时增加4.58% (95% CI:0.34%~8.99%)。

图6 不同年均温度下施用动物粪便对土壤细菌多样性指数的影响Fig. 6 Effects of animal manure application on soil bacterial diversity index at different annual temperatures

相较于单施无机肥，土壤细菌Shannon 多样性指数增加率随年均温度升高而降低（P<0.05），当年均温度≤5 ℃时增加率达41.16% (95% CI:27.55%~56.24%)，年均温度5~15 ℃和≥15 ℃ 时增加率略低，分别为25.97% (95% CI:16.28%~34.48%)、6.95% (95% CI:4.19%～9.78%)。土壤细菌Chao l 丰富度指数分析表明，年均温度5~15 ℃时增加率最高，达到5.24% (95% CI: 0.34%~10.41%)，其 次 为 年 均 温 度≥15℃时，达4.87%(95% CI: 1.66%~8.18%)，年均温度≤5 ℃时增加率最低，仅为1.82% (95% CI: 0.40%~3.25%)。

3 讨论

土壤微生物群落在维持生态系统稳定中发挥重要作用，对复杂化、模块化微生物网络的形成以及对提高土壤肥力、维持健康土壤微生态具有促进作用[27-28]。通过系统搜集中国各地区施用动物类粪便与土壤微生物多样性和丰富度相关的文献，以不施肥和单施无机肥作为对照，选择目前研究土壤微生物多样性和丰富度最具代表性的2 个数量指标：Shannon 多样性指数（Shannon 值越大，说明群落多样性越高）、Chao l 丰富度指数（Chao l值越大，表明物种总数越多），通过统计分析已发表的文献数据，结合Meta 分析方法，以不同影响因素为条件分析有机碳源物料输入后土壤细菌多样性指数响应特征。结果发现，与不施肥、单施无机肥相比，动物类粪便（鸡粪、牛粪、猪粪）施用显著提高了土壤细菌Shannon 多样性指数和Chao l丰富度指数（P<0.05），且对Shannon 多样性指数促进效果更佳。相关研究表明，施用鸡粪对豆科作物根际微生物的丰富度和多样性具有显著的促进作用[29]；长期施用猪粪对禾本科作物根际土壤微生物群落丰富度、均匀度和功能多样性具有显著的促进作用[30]；施用牛粪可以显著提高禾本科作物土壤微生物多样性和丰富度，且经牛粪处理的微生物多样性指数最高，并与微生物总量的变化趋势一致，而单施化肥和不施肥，土壤微生物多样性与总量的变化不显著[31]。分析其原因主要有：①动物类粪便施用有利于调节土壤pH，改善土壤孔隙状况和土壤团聚作用，增加土壤透气性，增强保水保肥能力，促进土壤养分转化、提高细菌基质的有效性、促使植物根系分泌物和和土壤中可溶性有机碳含量增加，促进微生物的生长繁殖[32-35]；②引入一些外源有益微生物种群，增加土壤微生物多样性和丰富度，提高根际土壤微生物代谢活性以及土壤酶活性，引起根际区系微生物群落的变化，营造物种丰富、功能多样化的土壤环境[36-38]；③鸡粪、牛粪、猪粪等动物粪便属热性肥料，具有丰富的有机质，氮、磷、钾含量相对较高，还具有碳氮比（C/N）低的特点，土壤C/N 与有机质分解速度呈反比关系，在生命活动过程中，土壤微生物需要碳和氮提供能量和物质构建生物体，且有机质分解速度的快慢对提高土壤微生物多样性起着关键作用[39-41]；④施用动物类粪便可有效地提高土壤氮、磷、钾等养分的含量，促使土壤真菌、细菌的磷酸脂肪酸（phospholipid-derived fatty acids, PLFA）含量显著增加[42-43]。

对动物类粪便施用下土壤微生物多样性变化的研究发现，相对于不施肥与单施无机肥，施用动物类粪便能促使西北地区、南方地区及北方地区的土壤细菌Shannon 多样性指数和Chao l 丰富度指数多样性显著提高；土壤微生物多样性和丰富度会受到年均气温、年均降水量等气候条件的影响。本研究表明，降水量于500~1 500 mm 时施用动物类粪便对土壤微生物多样性和丰富度的提升效果最强；总体上看，年均温度5~15 ℃时，土壤微生物多样性指数的提升最强，表明施用动物类粪便下，在该温度范围内微生物的生长繁殖最为旺盛。综合考虑区域、降水量以及年均温度三者关系，可知相比于不施肥或单施无机肥，在年均降水量大于500 mm、年均温度大于5 ℃的南方地区和北方地区，施用动物类粪便对土壤微生物多样性和丰富度的促进效果最强。土壤微生物多样性和丰富度对动物类粪便施用的响应特征受多种生物因子以及非生物因子的交互影响[44-46]。土壤微生物的组成和种群结构受时空、气候和营养条件等非生物选择以及物种间竞争和权衡等影响[47-48]；不同区域非生物结构、微生物相对丰度、微生物活性和微生物群落组成可能存在相当大的差异[49]；土壤细菌群落结构与自然条件存在交互性和协同效应，不同区域多样化的植被类型、自然条件、干湿条件、土壤理化性质、土壤类型、酶活性、通气性、温度和pH等对土壤微生物多样性具有显著的影响[50-52]；一定范围内气温和降水量较高可促进大量细菌繁殖，而较低仅促进小部分物种繁殖[53]；微生物代谢程度与温度和降水量的高低相关，适宜的温度和降水量可促进土壤微生物生长导致微生物量提高[54]。

已有研究中大部分文献数据量缺乏或没有详细的描述，同时影响土壤微生物多样性的因素很多且关系复杂，利用Meta 分析评价施用动物类粪便对其影响因素时，还有多种因素未能详尽的考虑。此外，在土壤微生物与环境条件、环境条件与环境条件之间存在复杂的交互作用，今后可结合网状Meta 分析、Meta 回归以及结构方程模型等方法，深入分析造成动物类粪便施用下土壤微生物多样性变化的主要影响因子，明确其作用机制，有助于生产实践中改善动物类粪便施用的推广策略，以发挥施用动物类粪便对改善土壤质量和降低土传病害的潜力。

Meta 分析结果表明，与不施肥与单施无机肥相比，单施动物类粪便或配施无机肥下土壤细菌多样性指数和丰富度指数显著增加，其中单施动物类粪便对其增加效果最好，且鸡粪、牛粪和猪粪对细菌多样性和丰富度的贡献高；建议在茄科、禾本科、豆科作物上实施动物类粪便配施技术；且不同区域、年均降水量、年均温度等均对其具有显著的影响，因此应结合区域因素、气候因素等条件因地制宜制定施肥方案，以达到肥料的最佳利用，并对作物、土壤、环境等起到良好的调节作用。此外应进一步对动物类粪便配施无机肥技术下土壤微生物多样性和丰富度的变化特征进行相关研究，探究土壤微生物多样性和丰富度对动物类粪便与无机肥配合施用的响应特征，对构建土壤微生态，营造“健康”土壤环境，进一步发挥其在改善土壤质量和提高土壤可持续利用的优势。