富硒乳酸菌发酵葡萄汁工艺条件及功能性成分研究

翟硕莉王岩张秀丰

(1.衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000；2.石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050000)

硒是人体必需且不能自身合成的微量元素，自然界的硒存在无机硒和有机硒2种形式，无机硒有毒性且人体难以吸收，有机硒如硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等毒性极低，人体可吸收利用[1]，且有研究表明，有机硒是谷胱甘肽过氧化酶的重要组成成分，一定量的硒摄入能够促进生长、对视觉器官有重要作用[2]，硒还具有清除自由基、抗癌、提高免疫力等功效[3]。硒的适量摄入有益于人体健康，从食品中摄入有机硒是膳食硒的有效补充方式。

近年来，有多项报道称通过微生物如酵母菌、乳酸菌可将食品中的无机硒转化为有机硒，在保障食品安全的前提下，本研究选择食品级乳酸菌进行发酵葡萄汁富集硒，通过对富硒乳酸菌发酵葡萄工艺条件的优化及发酵前后功能性物质的研究，评价乳酸菌发酵葡萄汁的多酚类物质、黄酮类物质及抗氧化活性，使硒元素与乳酸菌二者对人体的功效实现“1+1>2”的效果，以期研发一款集风味和功能性于一体的葡萄发酵制品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巨峰葡萄、脱脂乳、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、白砂糖、食品级柠檬酸、没食子酸标准品、芦丁标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、ABTS、铁氰化钾、果胶酶、福林酚试剂、硝酸、铁氰化钾等。

1.2 仪器与设备

培养箱、榨汁机、分光光度计、灭菌锅、阿贝折光仪、pH计、原子荧光光谱仪、微波消解仪等。

1.3 试验方法

1.3.1 富硒乳酸菌的制备

脱脂乳中加入亚硒酸钠(加入后浓度为0.8μg·L-1)，115℃，15min灭菌后，接入保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)，42℃恒温发酵至凝乳，即为富硒乳酸菌。

1.3.2 葡萄发酵工艺过程

巨峰葡萄→挑选、清洗→打浆→加入0.1%果胶酶酶解→8层纱布过滤→加辅料(白砂糖、柠檬酸)→均质→杀菌→冷却后接种→发酵→成品。

1.3.3 单因素试验和正交试验

固定发酵温度36℃，发酵时间12h，选取料水比3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3；加糖量3%、5%、7%、9%、11%；接种量1%、2%、3%、4%、5%，以发酵后pH值和感官评分为指标，以确定单因素的水平范围。

根据单因素试验得到的水平范围，设计L9(33)正交试验，见表1。

表1 正交试验因素水平设计

1.3.4 感官评价

评定小组成员为20名，男女各1/2人数，从3个方面进行感官评分，100分为满分，取平均分，对不同发酵条件的乳酸菌发酵葡萄汁饮料进行感官评分，感官评分标准表见表2。

表2 葡萄汁感官评分标准表

1.3.5 测定指标

1.3.5.1 pH值

发酵后葡萄汁搅拌均匀，pH计测定。

1.3.5.2 可溶性固形物含量测定

使用阿贝折光仪测可溶性固形物，以°Brix表示。

1.3.5.3 总酚测定

采用Folin-Ciocalteu[4]法在765nm下，测定贮藏期样品中的总酚。以没食子酸为标准品，吸光值为纵坐标(Y)，没食子酸浓度为横坐标(X)建立标准曲线，得回归方程：

Y=0.018X+0.0012，R2=0.9982

1.3.5.4 总黄酮测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法在510nm下，测定总黄酮含量[5]，以芦丁为标准品，吸光值为纵坐标(Y)，芦丁浓度为横坐标(X)建立标准曲线，得回归方程：

Y=0.0124X-0.0114

1.3.5.5 ABTS清除率测定[6]

配制7.4mmol·L-1ABTS，2.6mmol·L-1K2S2O8，等体积混合，避光室温下静置12h，即储备液。使用时以无水乙醇稀释，在734nm处使吸光值为0.7±0.02，即ABTS+工作液。

葡萄汁与ABTS+工作液反应，吸光值记为A1，葡萄汁与无水乙醇反应，吸光值记为A2，无水乙醇与ABTS+工作液反应，吸光值记为A0。

ABTS自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)/

A0]×100%

1.3.5.6 Fe3+还原力的测定

取0.2mL贮藏期葡萄汁，参考肖梦月等[7]的测定方法，在700nm处测各贮藏期葡萄汁的吸光值。

1.3.5.7 硒测定

采用GB 5009.93-2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》中的 第一法 氢化物原子荧光光谱法[8]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵葡萄汁工艺研究

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 料水比对发酵葡萄汁的影响

料水比决定着果汁中葡萄的使用量和发酵过程中乳酸菌提供的营养物质是否充足。从图1结果看，料水比过低，味道过淡，口感不佳；料水比过高，葡萄汁太粘稠，评分较低。料水比从1∶3增加到3∶1，pH值呈先下降再上升趋势，料水比2∶1时pH值稍高于1∶1，感官评分最高。

图1 料水比对葡萄汁pH的影响

2.1.1.2 加糖量对发酵葡萄汁的影响

乳酸菌利用葡萄中的碳水化合物进行发酵，白砂糖的加入使得发酵过程中产生的酸被中和，产生适口的酸甜感。由图2可知，加糖量3%～9%时，pH值逐渐降低，接种量11%时pH升高。可能是因为当加糖量过多时，乳酸菌不能将糖完全利用，导致pH升高。当加糖量为9%和11%时，感官评分较高，低于9%，口感偏酸。

图2 加糖量对葡萄汁pH的影响

2.1.1.3 接种量对乳酸菌发酵山楂汁的影响

如图3所示，随乳酸菌接种量的增加，发酵过程中产生较多的有机酸，pH逐渐降低，当接种量高于3%后，pH回升，可能是发酵底物不足以提供足够的营养，导致乳酸菌自溶。接种量为3%，感官评分最高。

图3 接种量对葡萄汁pH的影响

2.1.2 正交试验

由表3可知，当评价指标为感官评分，3个因素的主次影响顺序为C>A>B，最佳工艺参数为A2B2C2；当评价指标为pH值，主次影响顺序为A>C>B，最佳工艺参数为A2B3C3。从2个指标的数据分析结果看，加糖量对乳酸菌发酵葡萄汁工艺影响最小，从合理膳食的角度考虑，糖的摄入不宜过多，从口感角度考虑，接种量较大时酸度大，因此选择加糖量7%，接种量3%较适宜，最终确定工艺条件为A2B2C2。

表3 L9(33)正交试验表

2.1.3 验证试验

正交试验数据分析得出的最佳工艺条件为A2B2C2，即料水比2∶1，加糖量7%，接种量3%，在此条件下发酵葡萄汁，进行验证试验，结果测定pH值4.08，感官评分88.3，与正交试验表中的结果比较，pH值不是最低的，但感官评分最高，可能是糖酸比较适宜，因此可以选择A2B2C2作为最佳工艺条件发酵葡萄汁。

2.2 乳酸菌发酵葡萄汁理化指标和功能性物质变化

葡萄中富含有机酸、糖类、酚类物质、黄酮类物质、维生素、矿物质等，发酵过程中，乳酸菌以这些营养成分为底物改善葡萄汁的风味和功能特性。从表4可知，发酵后的葡萄汁的pH值降低了0.36，可溶性固形物降低了1.43°Brix，这是由于发酵过程中乳酸菌利用糖类物质生成了有机酸，使得葡萄汁pH值降低，可溶性固形物含量减少。

表4 葡萄汁发酵前后指标的变化

试验测得发酵后葡萄汁的总酚含量较发酵前增加了13.9%，总黄酮含量增加了18.2%。葡萄中含有的酚类物质以游离态和结合态2种形式存在，游离态酚被氧化导致总酚含量降低，酸性环境能够减缓氧化过程，而乳酸菌在发酵过程中产生的酚酶转化结合态酚，形成更多的游离态酚[9]。多酚类物质含量的增加能够清除更多的自由基，使得ABTS自由基清除能力增加，铁离子还原能力增强，加强了葡萄汁的抗氧化作用。葡萄汁中的硒含量从发酵前的0.07μg·mL-1增加到0.18μg·mL-1，说明发酵葡萄汁所用乳酸菌具有一定的富硒能力。

3 结论

本研究以食品级的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)混菌发酵葡萄汁，对其发酵工艺条件及发酵前后功能性成分和抗氧化活性进行了分析，乳酸菌混菌发酵葡萄汁能够提高总酚和总黄酮含量，从而达到一定的自由基清除能力和铁离子还原能力，同时葡萄汁中有机硒的含量增加了0.11μg·mL-1，说明该发酵葡萄汁具有一定的富硒功能和抗氧化功能。