膀胱癌患者癌组织ABCC4、miR-506-3p表达水平及临床意义

廖高源,何 超,刘 攀

德阳市第二人民医院泌尿外科,四川德阳 618000

膀胱癌是泌尿系统最常见的癌症之一,其发病与内在遗传因素及外在环境因素(如接触芳香胺类物质等)有关,其在全球范围内的死亡率和复发率较高,易复发和转移,发现时往往已是晚期癌症,可能导致预后不良[1]。临床治疗膀胱癌的方法很多,早期膀胱癌主要以膀胱切除术为主,晚期膀胱癌常采用综合治疗方案,包括放化疗、免疫治疗等,虽然膀胱癌的治疗方法多样,但患者近远期的生存率仍较低。因此,寻找新的预后指标以调整膀胱癌治疗方案是眼前的当务之急。超家族转运跨膜蛋白ABC(ATP-binding cassette)可根据人类的序列同源性和系统进化发育分为7个亚家族,命名为ABCA到ABCG,其中,ATP结合盒转运蛋白C4(ABCC4)是C型亚家族成员之一,也称为多药耐药蛋白4(MRP4)[2]。研究显示,ABCC4在多种人体组织表达,且与多种疾病的发生相关,被认为是一种新的有前景的治疗靶点[3]。以往的研究表明,ABCC4在癌症中发生异常表达,如ABCC4/MRP4在胰腺癌中表达上调,可促进胰腺肿瘤发生和转移[4]。微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA,通过以序列特异性方式抑制翻译或切割降解靶基因mRNA转录来调节蛋白质编码基因的表达。有报道显示,miRNA的失调与癌症发生发展有关,在膀胱癌组织已发现多个表达上调或下调的miRNA[5]。miR-506-3p是miRNA家族成员之一,定位于X染色体中,在多种癌症中表达异常,有研究发现miR-506在膀胱癌细胞系中的表达水平降低[6],然而,ABCC4、miR-506-3p与膀胱癌患者预后的关系尚不明确。本研究通过检测ABCC4和miR-506-3p的表达水平探讨ABCC4、miR-506-3p与膀胱癌患者临床病理特征、预后的关系,以期为寻找膀胱癌预后生物标志物和治疗靶点奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取的研究对象为本院2015年5月至2017年5月收治的78例膀胱癌患者,其中男55例、女23例,年龄在30～78岁、平均(55.26±4.21)岁。纳入标准:经术前活检和术后病理检查诊断为膀胱移行细胞癌;接受根治性膀胱切除术;为浸润性、多发性膀胱癌;临床资料完整,可完成随访。排除标准:参与其他研究者;有语言交流障碍者;肝脏功能不全、存在其他免疫性疾病者。本研究获得本院伦理委员会批准(审批号:20150402),所有患者知情并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(qPCR)法检测ABCC4 mRNA、miR-506-3p表达 术中收集所有患者膀胱癌组织及距离癌组织边缘≥3 cm的癌旁组织迅速置于液氮中,转移至-80 ℃保存备用。取50 mg组织参照Trizol试剂盒(货号:CD-13433-ML,武汉纯度生物科技有限公司)的方法提取总RNA,并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量浓度和完整度。将检测合格的RNA按照Prime ScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa公司,货号:RRO47AA)说明书进行逆转录得到cDNA。ABCC4和miR-506-3p的相对表达水平使用SYBR Green Master Mix(日本TaKaRa公司,货号:RR420L)试剂盒和ABI7500型RT-qPCR仪(美国ABI公司)进行RNA检测。PCR反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL,引物F/R(10 μmol/L)各1 μL,cDNA模板(<100 ng)1 μL,加ddH2O至20 μL。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,分别以GAPDH和U6作为内参基因,引物序列如下。ABCC4-F:5′-GGATCCAAGAACTGATGAGTTAAT-3′;ABCC4-R:5′-TCACAGTGCTGTCTCGAAAATAG-3′;miR-506-3p-F:5′-GACATGCATAAGGCACCCTTC-3′;miR-506-3p-R:5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′;GAPDH-F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′;内参基因GAPDH-R:5′-GGG TGTCGCTGTTGAAGT-3′;内参基因U6-F:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′;U6-R:5′-CAGGGGCCAT CCTAATCTT-3′。最终结果以2-ΔΔCt法计算,每组样品重复3次。

1.2.2免疫印迹法检测ABCC4蛋白表达 从组织提取蛋白质,采用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白,将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭60 min;然后按照抗体说明书,采用相应的抗体进行孵育,兔抗人ABCC4单克隆抗体购自北京索宝生物科技有限公司(货号:H00010257-K),山羊抗兔IgG(H+L)二抗购自碧云天生物技术公司(货号:A0277)。以β-actin为对照,采用增强发光法观察免疫印迹结果。使用Image J软件对扫描图像进行密度测定,以ABCC4/β-actin作为蛋白的相对表达水平。

1.2.3双荧光素酶试验 TargetScan Human网站搜索miR-506-3p靶基因,以pGL3为载体,根据搜索到的miR-506-3p与ABCC4的结合位点构建ABCC4突变型和野生型载体,将二者分别与miR-506-3p阴性对照和miR-506-3p mimic共转染膀胱癌细胞系BIU-87细胞(深圳市豪地华拓生物科技有限公司,货号:HTX2158C),转染使用LipofectamineTM2000试剂按照其说明书操作,继续培养24 h后消化、收集细胞,检测双荧光素酶相对活性,结果以荧光强度比值表示。

1.2.4ABCC4蛋白和miR-506-3p表达水平与临床病理特征的关系 以膀胱癌组织ABCC4蛋白和miR-506-3p相对表达水平的平均值为临界值将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组,分析ABCC4蛋白和miR-506-3p表达水平与临床病理特征的关系。

1.3随访 通过电话、短信、邮件和门诊复查等方式对78例膀胱癌患者进行随访。随访开始时间为手术当日,第1、2年每3个月进行1次随访,第3、4年每6个月进行一次随访,随访结束时间为2021年5月或膀胱癌患者死亡。由专人记录78例膀胱癌患者生存和死亡情况。随访率为100%,无失访患者。

2 结 果

2.1膀胱癌组织和癌旁组织ABCC4 和miR-506-3p蛋白及mRNA表达水平比较 膀胱癌组织ABCC4蛋白和mRNA表达水平均明显高于癌旁组织,而在膀胱癌组织miR-506-3p相对表达水平低于癌旁组织,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1和图1。

图1 膀胱癌组织和癌旁组织ABCC4蛋白表达水平

表1 膀胱癌组织和癌旁组织ABCC4 mRNA蛋白和miR-506-3p水平比较

2.2膀胱癌组织ABCC4蛋白和miR-506-3p表达与临床病理特征的关系 膀胱癌组织ABCC4蛋白表达与肿瘤分期、肿瘤最大径和淋巴结是否转移显著相关(P<0.05),miR-506-3p表达与肿瘤分期有关(P<0.05),二者均与患者性别、年龄、吸烟、手术切缘无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 膀胱癌组织ABCC4和miR-506-3p表达与临床病理特征的关系(n)

2.3膀胱癌组织ABCC4蛋白与miR-506-3p靶向及相关性分析 Pearson法相关性分析结果显示,膀胱癌组织ABCC4蛋白水平与miR-506-3p的表达水平呈负相关(r=-0.549,P<0.05)。TargetScan Human网站搜索显示,ABCC4为miR-506-3p的潜在靶基因,二者存在结合位点,见图2。双荧光素酶试验结果显示,相对于miR-506-3p阴性对照与ABCC4野生型载体,miR-506-3p mimic与ABCC4野生型载体的荧光素酶相对活性明显降低(P<0.05);相对于miR-506-3p阴性对照与ABCC4突变型载体,miR-506-3p mimic与ABCC4突变型载体的荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图2 ABCC4和miR-506-3p的靶向结合位点

注:aP<0.05。图3 荧光素酶相对活性比较

2.4ABCC4和miR-506-3p表达与膀胱癌患者预后的关系 随访统计结果显示,78例膀胱癌患者中生存44例,死亡34例,总生存率为56.41%。使用Kaplan-Meier法分析ABCC4和miR-506-3p表达与患者总生存率的关系,Log-rank检验结果表明,ABCC4高表达组患者总生存率(38.46%)明显低于低表达组(74.86%),差异有统计学意义(χ2=10.219,P<0.05);而miR-506-5p高表达组总生存率(71.79%)明显高于低表达组(41.03%),差异有统计学意义(χ2=7.508,P<0.05)。见图4。

注:A为ABCC4表达与患者总生存率的关系;B为miR-506-5p表达与患者总生存率的关系。图4 Kaplan-Meier生存曲线分析结果

2.5影响膀胱癌患者预后的危险因素分析 经SPSS22.0验证发现,各变量间均不存在多重共线性(容差均>0.1,方差膨胀因子均<10)。COX单因素及多因素回归分析结果显示,肿瘤分期及膀胱癌组织ABCC4蛋白、miR-506-3p表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响膀胱癌患者预后的危险因素分析

3 讨 论

膀胱癌是由于膀胱黏膜上发生恶性肿瘤引起的,分为非肌肉侵袭性肿瘤和肌肉侵袭性肿瘤,发病率极高,已经超越了前列腺癌,位于泌尿系统肿瘤疾病之首。尽管近几年在膀胱癌治疗方面取得了相当大的进步,但大多数晚期膀胱癌患者的化疗效果一般,需要寻找新的预后指标和有效的治疗策略,而了解影响膀胱癌发生发展的分子靶点可极大地改善其治疗效果和病预后。

ABCCs/MRPs家族是一类跨膜转运蛋白,家族成员中结构短的一部分保守性较低,其中ABCC4基因定位于人染色体13q32.1,是基因编码最短的成员,参与各种组织的正常发育,同时其输出的信号分子还能够促进各种癌症中的肿瘤生长,在肿瘤组织中的表达水平较高,ABCC4可介导化疗药物的外排,导致化疗效果不佳[7-8]。近年来,ABCC4基因与人类肿瘤发生的关系及其作为多药耐药家族成员与肿瘤耐药的关系越来越受到研究人员的关注。COLAVITA等[9]研究发现,与对照肾组织相比,MRP4在透明细胞性肾细胞癌中过表达,MRP4药物抑制引起细胞阻滞,脂质成分改变,细胞质脂滴增加,最终导致细胞凋亡,为未来评估MRP4作为透明细胞性肾细胞癌可能的新治疗靶点提供了的证据。一项关于胶质瘤的研究报告称,ABCC4胶质瘤细胞中表达升高,可能在耐药过程中起重要作用[10]。本研究结果表明,膀胱癌组织ABCC4 mRNA和ABCC4蛋白表达水平高于癌旁组织,且ABCC4蛋白表达与肿瘤分期、肿瘤大小和淋巴结转移相关,表示ABCC4/MRP4可能在膀胱癌的发生发展中发挥作用。SAHORES等[4]的研究报道,在腺癌患者中,与MRP4表达水平较低的患者相比,MRP4表达水平较高的患者总体生存期往往较短,表明高水平的MRP4表达预示与预后不良相关。本研究通过分析ABCC4与膀胱癌患者预后的关系发现,ABCC4高表达患者总生存率明显低于低表达患者,提示ABCC4表达水平变化可能与患者预后有关。另外,COX单因素和多因素分析结果显示,ABCC4是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素,进一步提示ABCC4可能作为预测膀胱癌患者预后的指标之一。

miRNA是一类非编码的RNA,主要通过结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)阻断mRNA的翻译或者降解mRNA。随着对miRNA研究的不断加深,研究人员发现miRNA可以作为不同类型癌症的生物标志物,在癌症的发生、发展和转移中发挥重要作用。一些高表达的miRNA可能通过抑制肿瘤抑制因子而发挥致癌基因的作用,相反的,低表达的miRNA可能通过负调控癌基因而发挥肿瘤抑制因子的作用[11]。越来越多的研究报道,miRNA在膀胱癌组织与癌旁组织出现差异表达。郭宗华等[12]报道,miRNA-342在膀胱癌组织表达降低,与晚期临床病理学特征和预后较差有关,可作为膀胱癌预后生物标志物。miRNA-145作为肿瘤抑制剂,在膀胱癌组织和细胞中表达下调,能够抑制细胞的迁移和侵袭,可能成为膀胱癌的潜在生物标志物或治疗靶点[13]。以往的研究证实了miR-506-3p在多种癌症表达下调,具有抑癌作用。miR-506-3p在鼻咽癌中表达下调,过表达抑制了肿瘤生长和转移[14]。卵巢癌组织miR-506-3p表达水平与癌旁非肿瘤组织相比也显著下调,其过表达影响肿瘤细胞周期进展和细胞凋亡[15]。miR-506-3p在前列腺癌细胞中显著低表达,其过表达能抑制肿瘤细胞的增殖[16]。与先前在鼻咽癌、卵巢癌和前列腺癌中的发现一致,本研究结果显示,与癌旁组织相比,膀胱癌组织的miR-506-3p表达水平显著降低,推测miR-506-3p可能参与了膀胱癌的发病过程。进一步分析发现miR-506-3p的表达与肿瘤分期有关,初步证实了miR-506-3p在膀胱癌的恶性进展中具有重要作用。

此外,本研究对miR-506-3p表达与膀胱癌患者预后的关系进行了分析,本研究结果发现miR-506-3p低表达组的总生存率明显较低,且miR-506-3p表达与患者预后独立相关,说明膀胱癌组织较低水平的miR-506-3p与患者预后不良有关,检测miR-506-3p表达有利于评估膀胱癌患者的预后情况。

有研究表明,miRNA对癌症组织广泛表达的ABC转运体具有调控作用[17]。生物信息学分析结果显示,ABCC4被预测为miR-506-3p的靶向蛋白。同时,有文献报道ABCC4为miR-506的直接靶标,它们之间呈反比关系[18]。本研究通过对膀胱癌组织ABCC4和miR-506-3p的表达水平进行相关性分析,发现二者表达水平呈负相关关系,且双荧光素酶试验结果显示miR-506-3p与ABCC4具有靶向关系。基于以上研究,笔者推测膀胱癌中miR-506-3p可能通过靶向ABCC4发挥肿瘤抑制的作用,但具体机制需要进一步研究。

综上所述,ABCC4在膀胱癌组织中表达上调,而miR-506-3p在膀胱癌组织中表达下调,二者表达与患者临床病理特征和预后有关。本研究结果可为膀胱癌的早期诊断、治疗和预后评估提供理论依据。但本研究仍存在缺陷,例如,仅着重分析了ABCC4和miR-506-3p表达情况及二者与患者预后的关系,未涉及体外实验,在下一步的研究中将补充相关细胞实验,继续探讨ABCC4和miR-506-3p在膀胱癌发生、发展中的作用。