早期自然流产患者绒毛组织中HO-1、MCP-1的表达及复发性自然流产的危险因素分析

龚国忠,程家亮,张孝廉,刘友迎,王昌明

1.遂宁市第一人民医院检验科,四川遂宁 629000;2.遂宁市中心医院输血科,四川遂宁 629000

自然流产是指在妊娠28周以前非人为目的导致的终止妊娠,在妊娠12周前发生SA称为早期自然流产(ESA)。研究显示,自然流产发生率为12%,其中80%以上为ESA[1],多表现为停经一段时间后出现早孕反应,伴有阴道出血,轻微下腹疼痛。我国将3次及以上在妊娠28周前发生胎儿丧失定义为复发性自然流产(RSA)[2]。RSA病因复杂,除了目前临床上已知的遗传基因缺陷、内分泌失调、子宫解剖结构异常、感染、生殖免疫等常见因素外,仍有部分患者流产原因未明[3]。相关研究显示,RSA风险随流产次数增加而升高,每流产一次,再次流产风险将增加11%左右,3次及以上流产可将再次流产风险增加至40%,RSA不仅会损害育龄女性的身心健康,还对其家庭造成较大影响[4],故探讨RSA的危险因素以指导临床干预对保障育龄女性的生育健康需求有重要意义。有研究发现,血红素氧合酶-1(HO-1)可能在母胎界面水平影响RSA的发生[5];单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)具有趋化性,能够激活体内中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的活性,产生大量细胞因子[6],也可能影响RSA的发生。鉴于此,本研究通过分析ESA患者绒毛组织中的HO-1、MCP-1表达情况,并探讨RSA的危险因素,为临床诊疗提供指导。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2021年5月遂宁市第一人民医院(以下简称本院)收治的164例ESA患者作为ESA组,另选取同期在本院行人工流产的164例正常妊娠孕妇作为对照组。纳入标准:(1)ESA组均符合《妇产科学》[7]中对ESA的诊断标准,既往自然流产史≤1次;(2)对照组术前B超可见胚芽及胎心搏动,月经规律,既往无流产史。排除标准:(1)因生殖细胞染色体异常、子宫发育异常、内分泌异常、感染及自身免疫性疾病而导致的流产者;(2)伴心脏病、高血压等内外科疾病史者;(3)伴凝血功能异常者;(4)伴传染性疾病者;(5)合并恶性肿瘤者;(6)因滥用药物而导致流产者;(7)因腹部受到外因性的刺激和损害而致流产者;(8)放置宫内节育器者。

ESA组年龄24～35岁,平均(28.52±3.16)岁,孕周5～12周,平均(7.68±1.82)周,体重指数(BMI)20～28 kg/m2,平均(23.92±3.51)kg/m2,既往有自然流产史75例;对照组年龄23～36岁,平均(27.90±3.43)岁,孕周6～12周,平均(8.24±1.36)周,BMI 21～28 kg/m2,平均(23.80±3.14)kg/m2。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会审核批准(审批号:201805-004)。所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理 清宫术或人工流产术后,在无菌条件下,采集自然流产和正常妊娠女性的流产绒毛组织,洗净血液后,放入冷冻管中,-80 ℃保存,用于石蜡切片制备。

1.2.2绒毛组织HO-1、MCP-1蛋白表达检测 取绒毛组织石蜡切片。常规脱蜡入水,枸橼酸盐缓冲液热抗原修复,山羊血清封闭液封闭后滴加一抗、二抗(生物素标记)、链霉卵白素(碱性磷酸酶标记)各50 μL,37 ℃孵育25 min;DAB显色15 min,冲洗,复染,脱水,封片。相关试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。根据染色强度记为0～3分,无染色为0分,棕黄色为3分;根据染色细胞阳性率记为0～4分,临界值分别为25%、50%、75%。将两项结果相乘,乘积<2分为阴性,≥2分为阳性。

1.2.3图像分析 将免疫组化切片放置于Olympus显微镜下,对所测视野进行精准定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入CMIAS真彩色图像分析系统,每张切片随机选择5个完整而不重叠的视野进行定量分析,根据免疫组化结果进行积分光密度(IOD)测定,计算平均IOD,以阳性染色细胞平均IOD作为HO-1、MCP-1表达水平。

1.2.4随访 采用电话或门诊复诊等方式对ESA组患者进行12个月的随访,随访期间连续发生3次及以上妊娠28周之前的自然流产判定为RSA。观察统计ESA组患者发生RSA情况,将发生RSA的患者纳入RSA组,未发生RSA的患者纳入非RSA组。

1.2.5ESA患者RSA的影响因素分析 以ESA组患者年龄、孕周、BMI及HO-1、MCP-1表达水平等为自变量,对自变量进行赋值:年龄(实测值),孕周(实测值),BMI(<25 kg/m2=0,≥25 kg/m2=1),既往自然流产史(无=0,有=1),HO-1表达水平(实测值),MCP-1表达水平(实测值)。将RSA发生与否作为因变量(发生=0,未发生=1)。分析自变量与因变量的关系,记录比值比(OR)。

2 结 果

2.1两组HO-1、MCP-1阳性率及表达水平比较 ESA组HO-1阳性率及表达水平均低于对照组(P<0.05),ESA组MCP-1阳性率及表达水平均高于对照组(P<0.05)。见表1和图1、2。

注:A为对照组绒毛组织中HO-1阴性表达;B为ESA组绒毛组织中HO-1阳性表达。图1 绒毛组织HO-1表达情况(SP法,×100)

注:A为对照组绒毛组织中MCP-1阴性表达;B为ESA组绒毛组织中MCP-1阳性表达。图2 绒毛组织MCP-1表达情况(SP法,×100)

表1 HO-1、MCP-1阳性率及表达水平[n(%)或

2.2RSA组和非RSA组患者临床资料比较 ESA组患者在12个月的随访期间,有23例患者发生RSA,发生率为14.02%(23/164)。RSA组和非RSA组患者年龄、孕周、BMI比较,差异无统计学意义(P>0.05);RSA组的HO-1表达水平低于非RSA组(P<0.05),既往有自然流产史患者占比和MCP-1表达水平高于非RSA组(P<0.05)。见表2。

表2 RSA组和非RSA组患者临床资料比较[n(%)或

2.3ESA患者RSA发生的影响因素分析 多因素Logistic回归分析结果显示,既往有自然流产史、HO-1低表达、MCP-1高表达均为ESA患者RSA发生的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 ESA患者RSA发生的影响因素分析

3 讨 论

妊娠是成功的半同种移植过程,胚胎能够完全被母体接受并存活,说明母胎之间一定存在着免疫耐受[8]。ESA在临床上较为常见,孕妇在孕早期多次发生自然流产后有发生RSA的风险,给育龄期孕妇身心及家庭带来负担。本研究结果显示,ESA患者随访12个月内RSA的发生率为14.02%,稍低于既往葛怡琳[9]研究结果中的17%,可能与样本量差异、个体差异等有关,但均表明ESA患者有发生RSA的风险。因此,需积极探讨影响ESA患者发生RSA的影响因素,为临床诊治提供指导。

胚胎受母胎界面免疫反应的影响进入子宫内膜,改变其血管,使胚胎受到血液滋养,逐渐成熟,倘若免疫状态失衡,胚胎将会出现血液供给不足,最终导致流产[10]。MCP-1通过参与免疫细胞的运动、迁移机制来影响胚胎期母胎界面的免疫反应[11-12]。绒毛组织中HO-l主要表达于胎盘功能的执行细胞,即滋养细胞,正常妊娠主要依靠滋养细胞功能和结构的完整性,HO-1不仅能够加快生成胆红素,还可将血红素及其相关有害物清除[13],以减少多种应激损伤的发生。本研究结果显示,ESA组MCP-1阳性率高于对照组,HO-1阳性率低于对照组,提示MCP-1阳性率升高、HO-1阳性率降低均与ESA的发生相关。原因可能是:母胎界面MCP-1表达上调可引起巨噬细胞的免疫活性异常,活跃的巨噬细胞分泌更多的MCP-1,促使大量巨噬细胞聚集,如此反复,从而导致胚胎死亡[14]。然而,HO-1阴性表达可能导致绒毛间的血红蛋白和血红素聚集,从而上调黏附分子表达,使免疫细胞被吸收,发生免疫排斥反应,最终导致ESA[15]。

RSA的病因较为复杂多样,大部分患者病因难以识别,对广大女性的生理、心理造成严重的影响,临床上较为难防难治。本研究结果发现,RSA组患者的HO-1表达水平低于非RSA组,既往有自然流产史患者占比和MCP-1表达水平高于非RSA组,且多因素Logistic分析显示这些均为RSA的影响因素。分析原因:自然流产可引起子宫内膜损伤和凝血异常,增加蜕膜发育不良、胎盘年龄等风险,影响再次妊娠。既往研究也证实流产次数越多,患者妊娠丢失率越高[16]。HO-1水平降低可破坏局部血管的舒张功能和滋养细胞功能,影响正常妊娠,造成胚胎组织种植稳固性较低,致使其发生脱落;同时,HO-1低表达可引起流入叶状绒毛膜血流量降低,从而使胎盘内出现血氧不足,导致局部缺血绒毛坏死,胎盘内毒素因子增多,使得抗炎作用减弱和抗氧化能力不足,最终导致RSA的发生[17]。MCP-1可趋化单核-巨噬细胞等炎性细胞向病灶部位聚集,从而进一步加重机体损伤。MCP-1水平升高促进单核-巨噬细胞分泌前列腺素E2,增加宫缩,从而诱发流产。MCP-1可诱导炎性细胞靠近母胎界面,促进胎盘滋养细胞凋亡,子宫内膜功能层发生的短而直的小动脉突发急性状况,引发胎盘出血、坏死等不良事件,最终导致流产[18]。

总之,妊娠本身是极其复杂的过程,本研究通过探讨ESA患者绒毛组织HO-1、MCP-1表达情况及RSA发生的危险因素,证实了ESA患者绒毛组织HO-1表达水平降低、MCP-1表达水平升高,并且HO-1低表达、MCP-1高表达均会引起RSA的发生。因此,建议临床上针对RSA患者监控上述指标水平,并积极采取措施进行治疗。