Combretastatin A-4衍生物的设计、合成及抗乳腺肿瘤活性初探

高祎婷, 丁茂鹏, 马 腾, 周昊天, 刘晓航, 孙晓飞, 马 成

(1.新疆第二医学院 药学院,新疆 克拉玛依 834000; 2. 新疆第二医学院 体育教学部,新疆 克拉玛依 834000; 3.新疆医科大学 药学院,新疆 乌鲁木齐 830000)

Combretastatin A-4(CA-4)从南非灌木Combretumcaffrum的树干中分离得到,其结构与秋水仙碱类似,是目前已知微管蛋白秋水仙碱结合位点抑制剂(Colchicine binding site inhibitors, CBSI)中活性最强的化合物之一(图1)[1-2]。CA-4水溶性差,且容易形成热力学上更稳定但活性更弱的反式CA-4异构体,使其难以进一步得到应用[3]。因此,对CA-4进行化学结构修饰、生物活性研究以及构效关系分析成为抗肿瘤新药研究的热点。

通过查阅活性结构修饰产物相关的文献,总结得到化合物CA-4的构效关系(图2)。李春葆等[4]在制备考布他丁A-4雾化剂时,发现CA-4结构中A环上的3个甲氧基是必要的活性基团,对其修饰会降低CA-4活性;连接A、 B环的双键必须为顺式[5],但是A、 B环之间的双键可以用杂环如噻唑、噻二唑、苯并呋喃和二氧戊环等替代[6-9],也可以用链状结构如羰基等替代[10-11]。LEE[12]发现一种具有二苯甲酮结构的微管蛋白聚合抑制剂,羰基的加入增加了整个分子活性,药效更强,目前处于Ⅱ期临床试验;苯并[b]呋喃环取代CA-4 B环的BNC105P可以改善药物的药代动力学性质[13],提高药物的生物活性,因而可用于治疗晚期恶性胸膜间皮瘤,目前已进入Ⅱ期临床试验阶段。同时B环上C-4位甲氧基是活性必需基团,而C-3位羟基则相对灵活可被修饰[14]。马中林等[15]研究发现,在B环引入氢键受体基团如F原子可增强结构活性。卤素的电负性可增强分子生物活性,促进跨膜转运并提高生物利用度。现今在先导化合物中引入卤素已经成为一种主要的结构修饰方法。

图2 CA-4的构效关系

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一组质膜相关的脂质激酶,由3个亚基组成,包括p85调节亚基、p55调节亚基和p110催化亚基。根据其结构不同,PI3K分为3类:I类,II类和III类,其中I类PI3K与肿瘤细胞生长关系最为密切,具有PI3Kα、 PI3Kβ、 PI3Kδ和PI3Kγ4种关键亚型[16]。 PI3Kα是PI3K家族中作为癌症治疗的主要靶点,其高表达与结肠癌[17]、乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、胃癌[20]、直肠癌[21]和卵巢癌[22]等癌症的发生发展密切相关。2019年,Alpelisib为FDA批准的第1个PI3Kα抑制剂,具有羰基、氟原子等活性基团,用于乳腺癌治疗,但该药物却有严重的浓度依赖性副作用和耐药性[23]。 BKM120作为一种泛PI3K抑制剂,对肿瘤细胞的抗增殖活性并不是通过抑制PI3K的4种亚型,而是由微管依赖性细胞毒性所致[24]。此外,将BKM120的嘧啶骨架替换为吡啶或三嗪骨架,可分别获得微管去稳定剂和PI3K抑制剂[25]。

本研究结合CA-4构效关系和Alpelisib的基团结构,利用基于受体的药物设计方法(Structure-base drug design, SBDD)对CA-4进行结构改造(图3),即保留A环和A环上的3个甲氧基,以羰基取代连接双键碳以保证顺式构型,苯并呋喃环取代B环,B环侧链引入烯苯卤素增效,从而缓解分子疏水性。依据结合活性自由能打分值筛选出9种活性高的衍生物,并进行衍生物与双靶点蛋白对接分析及可视化分析,最后经4步合成法化学合成目标化合物(图4),以期得到能够同时靶向微管蛋白和PI3K的双重抑制小分子化合物。

图3 CA-4衍生物的设计思路

图4 CA-4衍生物的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RY-2型显微熔点仪;WFH-203B型三用紫外分析仪;Unity-Inova 600型核磁共振仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标);Thermo Finnigan LCQ Advantage MAX型质谱仪;MYP19150型电动搅拌器;RE-52AA型旋转蒸发仪;AD340型酶标仪;CW-2000型超声仪;Pymol软件(Delano Scientific LLC); Auto Dock Tools 1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)。

3,4,5-三甲氧基苯乙酮、2-氟苯乙烯、3-氟苯乙烯、3,5-二氟苯乙烯、丙烯酸乙酯、双(三苯基磷)二氯化钯(Ⅱ)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氢氧化钠、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)、氯化钠、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、无水乙醇、甲醇、乙腈、三乙胺、茴香醛、盐酸、无水硫酸镁、无水碳酸钾、无水碳酸钠均为分析纯。细胞株MCF-7和MDA-MB-231由南方医科大学中医药学院申春燕课题组惠赠。

1.2 计算机辅助药物设计

本课题采用SBDD法[26-28],以微管蛋白和PI3K为结合受体,以CA-4和Alpelisib(BYL-719,已上市的PI3K抑制剂,图3)化学结构为参考,对结构修饰后的64种化合物进行分子对接。通过比较其结合自由能筛选出9种优势化合物并进行对接分析及可视化分析。

(1) 蛋白质受体准备

在蛋白质数据库(Protenin Data Bank, PDB.http://www.rcsb.org/)下载用于分子对接的受体蛋白:PI3Kα(PDB编号:4waf),分辨率为0.239 nm;微管蛋白(PDB编号:1sa0),分辨率为0.358 nm。使用软件PyMol(http://www.pymo l.org/)对4waf进行处理,去除里面包含的小分子配体。同时对1sa0处理,选取A链和B链2个微管蛋白结构单元,分离其中包含的秋水仙碱(CN2)配体。分离、去除配体后,使用AutoDockTools.1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)对受体进行删去结晶水,加入Gasteiger电荷和添加极性氢等操作后,生成对应的4waf.pdbqt和1sa0.pdbqt文件。

(2) 配体结构准备

将上述设计的60种分子、CA-4和Alpelisib使用ChemDraw 20.0以及Chem3D 20.0软件画出其3D结构并将其以.mol2的文件形式导出为1.mol2、 2.mol2···79.mol2、 CA-4.mol2和Alpelisib.mol2。再使用AutoDock Tools.1.5.6对配体进行去水、加全氢、加入Gasteiger电荷和合并非极性氢等处理,并检查其扭转键和旋转中心后输出为.pdbqt的文件以用于对接。

(3) 分子对接

利用AutoDockTools.1.5.6半柔性对接上述制作的配体和受体,设置算法为遗传算法(Genetic Algorithm),对接次数设置为50次,最大迭代次数设置为2.5×106,种群数目设置为150,其余数值均采用系统默认数值,通过将每个分子配体都与受体蛋白4waf和1sa0对接后得到结合自由能数据[29-30]。

1.3 合成

(1) 中间体化合物2-溴-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙酮(a)的合成

将3,4,5-三甲氧基苯基乙酮3.15 g(15.00 mmol)与无水乙醇30 mL加入三颈烧瓶中,使其溶解完全。将NBS(5.34 g, 30.00 mmol)溶解于装有80 mL无水乙醇的锥形瓶。将NBS的无水乙醇溶液缓慢滴加至三颈烧瓶中(30 min内加完),水浴45 ℃条件下进行反应,同时进行TCL监测,直到原料药点消失后方可停止反应,反应液浓缩后用饱和NaCl溶液洗涤,抽滤得到滤饼,然后用硅胶柱层析分离得到中间体化合物a,白色粉末,产率80.7%, m.p.64.5～65.5 ℃;1H NMRδ: 7.25(s, 1H, Ar—H), 7.27(s, 1H, Ar—H), 4.68(s, 2H, —COCH2Br), 3.94(s, 9H, —OCH3)。

(2) 中间体化合物2-羟基-5-碘-4-甲氧基苯甲醛(b)的合成

向乙腈(3 mL)中加入2-羟基-4-甲氧基苯甲醛152.00 mg(1.00 mmol),再加入p-TosOH 95.00 mg(0.50 mmol)。搅拌溶液15 min后,加入N-碘代琥珀酰亚胺225.00 mg(1.00 mmol)。室温下搅拌过夜,然后将所有的挥发物真空除去。柱层析后得到中间体化合物b,黄色粉末,产率70.6%, m.p.127～130 ℃;1H NMRδ: 11.45(s, 1 H, —OH), 9.68(s, 1H, —CHO), 7.88(s, 1H, Ar—H), 6.43(s, 1H, Ar—H), 3.94(s, 3H, —OCH3)。

(3) 中间体化合物(5-碘-6-甲氧基-苯并呋喃-2-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮(c)的合成

将化合物a1.44 g(5.00 mmol)、化合物b1.43 g(5.00 mmol)和K2CO31.38 g(10.00 mmol)置于三颈烧瓶中,使用30 mL丙酮溶解,TCL监测,在70 ℃下加热回流搅拌,直至原料点消失后停止反应,旋干部分丙酮后,加入少量蒸馏水,并用CH2Cl2(3×15 mL)萃取后合并有机相,有机相用饱和NaCl溶液洗涤3次,加入少量无水硫酸镁使其干燥,减压蒸馏得到粗产物,经过重结晶(V乙醇∶V乙腈=10 ∶1)得到中间体化合物c,棕黄色粉末,产率75.5%, m.p.143～144 ℃;1H NMRδ: 8.14(s, 1H, Ar—H), 7.41(s, 2H, Ar—H), 7.08(s, 1H, C=C—H), 3.95(s, 3H, —OCH3), 3.93(s, 6H, 2—OCH3), 3.82(s, 3H, —OCH3)。

(4) 目标化合物的合成

室温条件下,将化合物c0.47 g(1.00 mmol)溶解在装有DMF 3 mL的三颈烧瓶后依次加入Et3N 0.30 g(3.00 mmol), PdCl2(PPh3)20.06 g(0.08 mmol)。在电动搅拌下缓慢加入卤代苯乙烯(4.00 mmol),滴加完毕后加热到60 ℃,加热回流,TCL监控,反应约24 h后待原料点消失,反应结束。冷却至室温并加入10 mL乙酸乙酯搅拌2 h,用饱和NaCl溶液洗涤3次,收集有机相并用无水硫酸镁干燥,浓缩后得粗产物,再利用无水乙醇重结晶后得到目标化合物[31-33],目标化合物的化学结构通式见图5。

图5 目标化合物的化学结构

目标化合物1: (E)-1-(2-氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率40.6%, m.p.173～174 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.93(s, 1H, H-4), 7.5(s, 1H, H-7), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.59(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.23(d, 1H,J=25.5 Hz, H-13), 7.08(dt, 1H,J=1.8 Hz, 9.6 Hz, H-14), 7.16(dt, 1H,J=1.8 Hz, 9.6 Hz, H-15), 7.66(d, 1H,J=10.5 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.3(C-3a), 125.4(C-4), 120.2(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.7(C-8), 125.3(C-9), 125.6(C-10), 121.6(C-11), 161.1(C-12,JCF=234.0 Hz), 115.9(C-13), 128.5(C-14), 124.2(C-15), 127.0(C-16), 132.6(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 463.1479{[M+H]+}, found 463.1551。

目标化合物2: (E)-1-(2-氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率58.4%, m.p.165.3～166 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.94(s, 1H, H-4), 7.5(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.54(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.38(dd, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-13), 7.28(t, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-14), 7.20(t, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-15), 7.75(dd, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.4(C-3a), 125.2(C-4), 120.3(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.4(C-9), 125.7(C-10), 133.4(C-11), 135.7(C-12), 129.8(C-13), 128.5(C-14), 126.6(C-15), 126.9(C-16), 132.5(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 479.1183{[M+H]+}, found 479.1258。

目标化合物3: (E)-1-(2-溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率41.1%, m.p.166.2～168 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 8.08(s, 1H, H-4), 7.51(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.45(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.66(dd, 1H,J=9.0 Hz, 2.4 Hz, H-13), 7.43(dt, 1H,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, H-14), 7.24(dt, 1H,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, H-15), 7.84(dd, 1H,J=9.0 Hz, 2.4 Hz, H-16), 3.79(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.99(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 156.5(C-2), 117.7(C-3), 120.2(C-3a), 123.2(C-4), 119.6(C-5), 152.7(C-6), 95.7(C-7), 158.9(C-7a), 181.2(C-8), 127.0(C-9), 127.3(C-10), 137.1(C-11), 135.7(C-12), 133.4(C-13), 127.0(C-14), 127.4(C-15), 127.3(C-16), 132.6(C-1′), 106.6(C-2′, 6′), 152.7(C-3′, 5′), 142.5(C-4′), 56.1(—2OCH3), 60.1(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 525.0678{[M+H]+}, found 525.0750。

目标化合物4: (E)-1-(3-氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率50.3%, m.p.178～179 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.89(s, 1H, H-4), 7.33(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.50(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.06(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.33(d, 1H,J=3.0 Hz, H-12), 6.96(m, 1H, H-14), 7.28(t, 1H,J=10.5 Hz, H-15), 7.49(d, 1H,J=1.8 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.3(C-2), 116.8(C-3), 120.1(C-3a), 122.6(C-4), 120.2(C-5), 152.1(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 124.6(C-9), 125.0(C-10), 140.1(C-11), 112.7(C-12), 164.2(C-13,JCF=294.0 Hz), 114.4(C-14), 130.1(C-15), 128.3(C-16), 132.5(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 463.1479{[M+H]+}, found 463.1553。

目标化合物6: (E)-1-(3-氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率60.7%, m.p.155～157 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.88(s, 1H, H-4), 7.33(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.53(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.06(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.50(d, 1H,J=1.8 Hz, H-12), 7.22(d, 1H,J=9.6 Hz, H-14), 7.29(d, 1H,J=9.6 Hz, H-15), 7.40(d, 1H,J=9.6 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.4(C-3a), 125.2(C-4), 120.3(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.7(C-9), 126.9(C-10), 135.7(C-11), 126.6(C-12), 133.4(C-13), 128.5(C-14), 129.8(C-15), 125.4(C-16), 132.5(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 479.1183{[M+H]+}, found 479.1257。

目标化合物11: (E)-1-(3-溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率46.2%, m.p.172.5～174 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.88(s, 1H, H-4), 7.50(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.52(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.02(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.70(d, 1H,J=2.4 Hz, H-12), 7.38(d, 1H,J=9.6 Hz, H-14), 7.23(t, 1H,J=9.6 Hz, H-15), 7.45(d, 1H,J=9.6 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.8(C-3), 120.2(C-3a), 124.8(C-4), 120.1(C-5), 152.1(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.0(C-9), 125.3(C-10), 139.9(C-11), 130.2(C-12), 122.9(C-13), 130.4(C-14), 129.3(C-15), 127.9(C-16), 132.5(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 545.0576{[M+Na]+}, found 545.0606。

目标化合物12: (E)-1-(3,4-二氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率48.5%, m.p.168.2～169 ℃;1H NMRδ: 7.85(s, 1H, H-7), 8.06(s, 1H, H-4), 7.49(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.57(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.24(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.86(d, 1H,J=1.8 Hz, H-12), 7.62(d, 1H,J=10.2 Hz, H-15), 7.61(dd, 1H,J=10.2 Hz, 1.8 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.80(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.5(C-2), 116.7(C-3), 120.4(C-3a), 124.4(C-4), 120.3(C-5), 152.2(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 126.2(C-9), 126.7(C-10), 140.8(C-11), 127.2(C-12), 124.8(C-13), 135.2(C-14), 124.8(C-15), 127.2(C-16), 132.4(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 513.0793{[M+H]+}, found 513.0869。

目标化合物18: (E)-1-(3,5-二氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率52.9%, m.p.194～196 ℃;1H NMRδ: 7.50(s, 1H, H-7), 8.05(s, 1H, H-4), 7.85(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.57(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.25(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.35(s, 1H, H-12), 7.12(s, 1H, H-14), 7.35(s, 1H, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.80(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.0(C-2), 117.9(C-3), 121.3(C-3a), 123.7(C-4), 120.1(C-5), 151.3(C-6), 95.1(C-7), 158.8(C-7a), 181.7(C-8), 126.3(C-9), 127.2(C-10), 141.4(C-11), 109.4(C-12), 161.9(C-13,JCF=245.0 Hz), 102.1(C-14), 161.9(C-15,JCF=240.0 Hz), 109.4(C-16), 132.1(C-1′), 106.7(C-2′, 6′), 152.8(C-3′, 5′), 141.6(C-4′), 56.1(—2OCH3), 60.2(—OCH3), 56.4(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 481.1384{[M+H]+}, found 481.1459。

目标化合物20: (E)-1-(3,5-二溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黄色粉末,产率53.8%, m.p.177.5～179 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.86(s, 1H, H-4), 7.50(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.53(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 6.99(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.40(d, 1H,J=2.4 Hz, H-12), 7.24(d, 1H,J=1.8 Hz, H-14), 7.40(d, 1H,J=2.4 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.5(C-2), 116.7(C-3), 120.4(C-3a), 124.4(C-4), 120.3(C-5), 152.2(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 126.2(C-9), 126.7(C-10), 140.8(C-11), 127.2(C-12, 16), 124.8(C-13), 135.2(C-14), 124.8(C-15), 132.4(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 600.9783{[M+H]+}, found 600.9858。

1.4 活性测试

分别将MCF-7和MDA-MB-231细胞以5×104个·mL-1的密度接种于96孔板,每孔加量为100 μL,并置于37 ℃、 5% CO2恒温箱24 h。实验组为0.1～200.0 μmol·L-1的目标化合物,阳性对照组为CA-4和Alpelisib。将实验组和阳性对照组置于37 ℃、 5% CO2环境条件下培养48 h后,吸掉孔内液体,加入现用现配的含5 mg·mL-1MTT 10%的培养液100 μL,孵育4 h后,弃孔内液体,加入150 μL DMSO,振荡30 s,待紫色结晶物完全溶解,用酶标仪测定570 nm处OD值,计算化合物对细胞生长增殖的抑制率。

2 结果与讨论

2.1 分子对接分析

通过对CA-4进行结构分析,设计出2类B环取代化合物,即烯苯卤素取代和炔苯卤素取代。为了提高合成的效率,减少盲目化学合成,本文对原配体、CA-4和Alpelisib等63种化合物进行了微管蛋白和PI3K的双靶点蛋白结合自由能分析(表1)。对比发现,该类结构整体上与双靶点结合性良好,且烯苯卤素取代优于炔苯卤素取代。筛选与PI3K对接活性≤-7.9 kcal·mol-1,与微管蛋白对接活性≤-8.9 kcal·mol-1的目标化合物1、2、3、4、6、11、12、18和20进行分子对接分析及可视化分析(表2)。氢键的键能小于共价键而大于分子间作用力,在化合物与蛋白分子结合力中具有重要作用。目标化合物1与1sa0蛋白的结合自由能为-9.5 kcal·mol-1,与CA-4相比,其值更低。目标化合物1A环上甲氧基的氧原子与1sa0蛋白中的THR-353形成3个氢键,其中2个为强氢键(0.18 nm),另1个为较强氢键(0.34 nm);与ASP-329形成1个键长为0.25 nm的强氢键和1个键长为0.35 nm的较强氢键。羰基桥上的氧原子分别与LYS-352和PRO-175形成1个强氢键(0.19 nm)和1个较强键(0.35 nm)。呋喃环上的氧原子与ASN-349形成1个键长为0.19 nm强氢键。由于这8个氢键的作用使小分子能与1sa0蛋白形成较稳定的复合物,结合自由能较低,因而结合效果较好(图6)。目标化合物1与4waf蛋白的结合自由能为-8.5 kcal·mol-1,与CA-4和Alpelisib相比,结合自由能较低,其A环上C-3甲氧基的氧原子与4waf蛋白中的GLN-478形成了1个较强氢键(0.33 nm)。呋喃环C-6的甲氧基上的氧原子分别PRO-5和ARG-4形成2个较强氢键,键长分别为0.34 nm和0.36 nm(图7)。综上所述,目标化合物1具有较好的微管蛋白和PI3K双靶点抑制活性。

表1 设计的CA-4衍生物与PI3K和微管蛋白双靶点的结合自由能

表2 目标化合物分子的对接可视化(氢键)

2.2 中间体化合物的合成方法分析

中间体化合物a和b是整个反应可以顺利进行的前期基础,本文各考察了2种合成方法,见表3。中间体化合物a的合成:方法(1)用甲醇作溶剂,常温反应,加入液溴,反应时间较长,反应不完全,且液溴具有毒害性与腐蚀性,安全性较差;方法(2)用无水乙醇作溶剂,加入NBS,反应温度升高,需45 ℃水浴,但反应时间缩短,且产物纯度较高,经重结晶即可得到,故选方法(2)合成中间体化合物a。中间体化合物b的合成:方法(1)用乙腈作溶剂,常温反应,加入碘单质,反应速度较快,4 h即可,但产率较低,不易分离;方法(2)使用了NIS,反应时间延长至10 h,但产率较高,经硅胶柱层析易得到,故选方法(2)合成中间体化合物b。综上,相较与单质溴和碘,使用的溴代试剂和碘代试剂化学合成产率高、副产物少且反应过程易于监控。

表3 中间体化合物a和b的合成方法考察

2.3 抗肿瘤活性

本实验测定了目标化合物对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231体外抗增殖的活性,结果见表4。从整体来看,目标化合物对2种肿瘤细胞均有一定抑制作用,但对MCF-7细胞作用较好。其中目标化合物18的活性较突出,2个氟原子的引入使该类化合物对MCF-7和MDA-MB-231细胞均具有良好的活性,IC50<10 μM。此外,目标化合物4对MCF-7肿瘤细胞也有较好的抑制作用,但对MDA-MB-231细胞的抑制效果不佳。由目标化合物3、11和20的的抑制活性可知,溴原子的引入使化合物对肿瘤的抑制作用不佳,可能是溴原子体积大、疏水性强和电负性弱导致。另外,阳性对照CA-4抗瘤效果不理想,可能是因为生成反式CA-4异构体,活性降低。

表4 目标化合物对MCF-7和MDA-MB-231 肿瘤细胞作用的IC50值

3 结论

本研究利用SBDD技术,采用活性基团协作的方法,对CA-4进行秋水仙碱和PI3K双靶点结构改造,保留A环及3个甲氧基,以羰基取代连接双键碳以保证顺式构型。苯并呋喃环取代B环,B环侧链引入烯苯卤素增效,筛选出活性自由能≤-7.9 kcal·mol-1的9种双靶点衍生物,对其进行分子对接分析及可视化分析,并通过碘代、溴代、Rap-Stereomer偶联反应和Heck偶联反应进行全合成,期间对关键的中间体化合物a和b的合成方法进行了考察,结果发现:与单质相比,使用溴代试剂和碘代试剂化学合成产率均在67%以上且副产物较少。本实验目前只检测了目标化合物对2种乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖抑制活性,并发现具有一定的抑制作用,其中目标化合物18对2种细胞的IC50<10 μM,揭示该类化合物具有抗肿瘤活性。后期将在多种不同类型肿瘤细胞株上进行进一步试验,发现敏感细胞株和活性较优化合物,进而开展后续双靶点活性检测试验。