猪Nramp1基因及其蛋白生物信息学分析

杨 兵, 刘孟学, 赵春芳, 阮崇美, 许金根*

(1.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100;2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

天然抗性相关巨噬细胞蛋白1(Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1,Nramp1),又称溶质载体转运家族11成员1(Solute Carrier Family 11 Member 1,SLC11A1),是一种离子转运蛋白,可抵抗多种胞内病原菌的侵染而发挥免疫功能[1]。

猪Nramp1基因的cDNA序列已被克隆出来,编码538个氨基酸,包含15个外显子和14个内含子[2-3]。作为免疫候选基因,目前已在中外多个猪品种中开展了Nramp1基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)研究。刘丽霞等[4]研究称,除杜洛克猪外,大白猪、长白猪、八眉猪、蕨麻猪、烟台黑猪Nramp1基因第2外显子均存在2个SNPs。相德才等[5]检测发现,迪庆藏猪Nramp1基因第2内含子和第2外显子都具有多态性。张斌等[6]研究表明,滇陆猪第5外显子至第6外显子区域发现3个SNPs,且SNP2位点AA和AG型个体间的肝脏相对表达量存在显著差异。此外,Nramp1与动物机体的抗病性有关,研究者开展了该基因多态性与猪免疫力指标、抗病性状的关联分析。Wu等[7]报道,大白猪Nramp1基因内含子6不同基因型个体的单核细胞毒性百分率、中性粒细胞还原力存在显著差异。赵生国等[8]表明,猪Nramp1基因外显子2和内含子6处的多态位点都显著影响大白猪、长白猪和杜洛克仔猪腹泻评分。Cho等[9]发现,Nramp1基因多态位点(523G/A)显著影响断奶后仔猪的成活率。

目前,有关猪Nramp1基因的研究主要是对多态性及其抗病性状的相关性研究。因此,本研究基于生物信息学分析了猪Nramp1基因及其编码蛋白序列的结构特征,为该基因在猪抗病育种中的应用提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 试验序列

在NCBI的GenBank数据库下载猪Nramp1基因mRNA序列(NM_213821),以及猪(NP_998986)、人(NP_000569)、小鼠(NP_038640)、普通牛(NP_777077)、水牛(XP_006046464)、绵羊(AAC28241)、山羊(NP_001272623.1)的Nramp1蛋白序列。

1.2 试验方法

用ExPASy数据库分析猪Nramp1蛋白的理化性质、亲水性;用SOPMA软件分析蛋白的二级结构;用CBS数据库预测蛋白的信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、N-糖基化位点;用STRING软件分析蛋白互作网络;用DNAStar软件分析蛋白序列的同源性。

2 结果与分析

2.1 猪Nramp1基因编码区序列分析

NCBI收录的猪Nramp1基因的编码区长为1 617 bp,碱基组成见表1,其中G-C含量(58.50%)高于A-T含量(41.50%)。

表1 猪Nramp1基因编码区的碱基组成

2.2 猪Nramp1蛋白的理化性质分析

经ProtParam预测,猪Nramp1蛋白的分子量为58 829.22 u,等电点为8.01,不稳定系数为44.76,平均亲水系数为0.605。猪Nramp1蛋白的氨基酸组成见图1,其中亮氨酸数(85个)最多,色氨酸数(8个)最少。

图1 猪Nramp1蛋白的氨基酸组成Fig.1 The amino acid composition of pig Nramp1 protein

经ProtScale预测(Kyte&Doolittle法),猪Nramp1蛋白含有的疏水性氨基酸残基较多,这与ProtParam预测结果一致,其中第499位的值最大,为3.056,而第268位的值最小,为-2.778(图2)。

图2 猪Nramp1蛋白亲疏水性预测Fig.2 Prediction of the hydrophilicity and hydrophobicity of pig Nramp1 protein

2.3 猪Nramp1蛋白的信号肽和跨膜区分析

经SignalP 6.0软件预测,猪Nramp1蛋白不存在信号肽(概率为0.999 9,图3)。

图3 猪Nramp1蛋白信号肽预测Fig.3 Prediction of the signal peptide of pig Nramp1 protein

经DeepTMHMM软件预测,猪Nramp1含有12个跨膜区,分别位于62～75、89～104、134～157、165～185、192～213、238～256、281～304、358～378、405～415、427～444、464～484和492～513处(图4)。

图4 猪Nramp1蛋白跨膜结构预测Fig.4 Prediction of the transmembrane structure of pig Nramp1 protein

2.4 猪Nramp1蛋白的二级结构

经SOPMA软件预测,猪Nramp1蛋白的二级结构含有α螺旋、无规卷曲、延伸链和β转角(图5),分别占55.58%(299个)、26.95%(145个)、14.13%(76个)和3.35%(18个)。

图5 猪Nramp1蛋白二级结构预测Fig.5 Prediction of the secondary structure of pig Nramp1 protein注:h为α螺旋;e为延伸链;t为β转角;c为无规卷曲。

2.5 猪Nramp1蛋白磷酸化和N-糖基化位点分析

经NetPhos 3.1软件预测,猪Nramp1蛋白有40个潜在的磷酸化位点(预测值>0.5,图6),包括24个丝氨酸位点(第11、17、19、20、21、23、37、51、66、145、229、258、263、323、371、393、403、423、433、458、467、468、483和527位)、12个苏氨酸位点(第13、34、59、114、132、153、206、269、375、377、401和514位)和4个酪氨酸位点(第15、69、183和209位)。

图6 猪Nramp1蛋白磷酸化位点预测Fig.6 Prediction of phosphorylation sites of pig Nramp1 protein

经NetNGlyc 1.0软件预测,猪Nramp1蛋白有2个N-糖基化位点,位于第321和335处(预测值>0.5,图7)。

图7 猪Nramp1蛋白N-糖基化位点预测Fig.7 Prediction of N-glycosylation sites of pig Nramp1 protein

2.6 猪Nramp1蛋白互作网络分析

经STRING软件预测,与猪Nramp1(即SLC11A1)互作的蛋白有TLR4、SLC39A14、ATP7A等(可信度>0.4,图8)。

图8 猪Nramp1蛋白互作网络分析Fig.8 Interaction network analysis of pig Nramp1 protein

2.7 Nramp1蛋白序列的同源性分析

经MegAlign(Clustal W法)分析,猪Nramp1蛋白序列与水牛、普通牛、山羊、人、小鼠、绵羊的同源性分别为87.2%、88.1%、87.7%、86.8%、84.4%和88.5%(图9)。

图9 猪Nramp1蛋白序列同源性分析Fig.9 Homology analysis of pig Nramp1 protein sequences

3 结论与讨论

疾病威胁畜禽的健康且阻碍畜牧业的发展,抗病育种研究是解决此问题的一条途径。研究发现,大肠杆菌刺激猪肠上皮细胞后,Nramp1基因的表达量显著上升[10],表明Nramp1基因与猪的抗病性相关。基于公共的分子生物学数据库和生物信息学分析,为预测畜禽基因及其编码蛋白的功能提供基础[11-12]。

本研究对NCBI公布的序列(NM_213821)进行分析,猪Nramp1基因编码区长为1 617 bp,G-C含量(58.50%)高于A-T含量(41.50%)。猪Nramp1蛋白的相对分子量为58 829.22 u,等电点为8.01,为不稳定(不稳定系数44.76>40)的疏水性蛋白(平均亲水系数0.605>0)。猪Nramp1蛋白由538个氨基酸残基组成,其中亮氨酸数量(85个)最多,而色氨酸数量(8个)最少。

本试验预测发现,猪Nramp1蛋白没有信号肽结构,二级结构主要由α螺旋和无规卷曲构成,这与荷斯坦牛Nramp1蛋白的信号肽、二级结构预测结果相似[13];而猪Nramp1蛋白预测含有12个跨膜区,这与绵羊Nramp1蛋白的跨膜数一致[14]。另外,本研究预测猪Nramp1蛋白有40个磷酸化位点(包括24个丝氨酸、12个苏氨酸和4个酪氨酸位点)以及2个N-糖基化位点,表明这些氨基酸残基是猪Nramp1蛋白翻译后潜在的修饰位点。预测显示,与猪Nramp1互作的蛋白有TLR4等蛋白。TLR4是调控仔猪腹泻的抗病基因[15],这也间接反映Nramp1在猪免疫应答中发挥作用。

7个哺乳动物Nramp1蛋白的序列分析表明,猪与人、小鼠、普通牛、水牛、山羊、绵羊Nramp1蛋白序列的同源性均大于80%,提示Nramp1蛋白的保守性较高。当前对猪Nramp1蛋白的结构和功能研究较少,鉴于Nramp1蛋白在物种进化中具有保守性,可参考人、小鼠等动物Nramp1蛋白的功能研究。

综上,猪Nramp1预测为不稳定的疏水性蛋白,无信号肽,但存在12个跨膜区,含有40个磷酸化和2个N-糖基化位点,其蛋白序列在物种间保守性较高,试验结果为进一步研究猪Nramp1基因的功能积累基础资料。