兴安杜鹃精油最佳提取工艺及抑菌性

檀婷婷,吴生海,王玉莹,杨春波,洪海成,刘庆忠,魏曦光,杜凤国,2

(1.北华大学林学院,吉林 吉林 132013;2.长白山特色森林资源保育与高效利用国家林业局重点实验室,吉林 吉林 132013)

兴安杜鹃(RhododendrondauricumL.)为杜鹃花科、杜鹃花属落叶或半常绿灌木,花红色或紫红色,先花后叶,观赏价值高;枝叶可提取芳香油,并可入药.兴安杜鹃是一种集观赏、药用于一身的珍贵经济植物,应用潜力大[1].目前,兴安杜鹃研究主要集中在种子形态及萌发特性[2-3]、种实表型性状[4]、生理生态特性[5-6]、繁殖方式[7-9]、药用价值[10-13]、园林应用[14-15]等方面.在精油研究方面,虽有学者采用气质联用仪分析了兴安杜鹃精油的化学成分[16],但对精油最佳提取工艺、抑菌活性的研究还未见报道.精油在植物体内含量低,因此,有必要探索其高效提取工艺[17],而响应面法是广泛应用于最佳提取工艺优化的一种方法[18];抑菌性是精油的一个广谱性功能,作为天然抑菌剂,精油对多种细菌具有抑制作用[19].因此,本研究以兴安杜鹃枝叶为材料,采用水蒸气蒸馏法确定精油的最佳提取工艺,分析化学成分,检测精油抑菌活性,确定最低抑菌质量浓度,为兴安杜鹃精油的综合利用提供依据.

1 材料试剂、仪器设备与研究方法

1.1 材料试剂

试验材料为采自吉林市江密峰镇野生兴安杜鹃的叶、1 a生枝和多年生枝,经鉴定为兴安杜鹃.

无水硫酸钠和氯化钠购自天津市大茂化学试剂厂,无水乙醇和正己烷购自天津市致远化学试剂有限公司.制作培养基所用的蛋白胨、琼脂粉和牛肉膏等购自北京奥博星生物技术有限公司;抑菌试验所用菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄葡萄球菌,购自上海鲁微科技有限公司,保存于国家林业局重点实验室微生物分室;营养肉汤琼脂培养基(NA)和营养肉汤培养基(NB)为抑菌试验用培养基,上述试剂均为分析纯.

1.2 仪器设备

气相色谱-质谱联用仪,Agilent7890A-5975C,Agilent公司;植物粉碎机,WK-1000A,佛山市顺德区正大电机公司;恒温培养箱,新苗SPX-25085-Ⅱ,上海新苗医疗器械制造有限公司;调温电热套,DZTW,北京市永光明医疗仪器有限公司;振荡培养箱,HDL-HZQ-F160,北京东联哈尔仪器制造有限公司.

1.3 研究方法

1.3.1 精油最佳提取工艺

在容积为10 L的圆底烧瓶中加入已粉碎并过20目筛网的兴安杜鹃粉末样品100 g,之后加入600 mL质量分数为4%的 NaCl 溶液,进行水蒸气蒸馏试验.当蒸馏至煮沸时观察出油情况,每间隔10 min记录一次数据,当观察到出油量不再增加时停止加热,并静置至水油完全分层.将下层的水排出后收取上层精油,使用无水硫酸钠吸取精油中剩余的水后,将精油吸取至样品瓶放于4 ℃冰箱中密封保存,计算精油提取率.以蒸馏时间(A)、液料比(B)和NaCl质量分数(C)为试验因素,探究不同条件对兴安杜鹃精油提取率的影响,具体水平见表1.以兴安杜鹃提取率为指标,设计L9(3)正交试验,进行响应面分析,优化兴安杜鹃精油提取工艺.全部试验重复3次,试验结果取均值进行计算.

表1 正交试验因素水平设计

1.3.2 兴安杜鹃精油化学成分分析

使用气相色谱-质谱联用仪分析兴安杜鹃精油的化学成分,条件设置如下.1)GC分析条件:氦气作为载气,色谱柱为DB-17MS毛细管柱,初温为50 ℃,保持5 min后进行程序升温.以3.5 ℃/min升温至220 ℃后继续以5 ℃/min升温至240 ℃,进样口温度250 ℃.进样量1.0 μL,分流进样时的分流比为20∶1,体积流量为1.03 mL/min.2)MS分析条件:电子轰击离子源,温度为200 ℃,轰击电压的电子能量为70 eV,相对分子质量扫描范围为全扫描.将GC-MS检测出的成分在GC-MSD化学工作站完成匹配度检索,通过NIST 2008、文献检索和人工解析等对兴安杜鹃精油成分进行联合分析鉴定,确定各成分后根据峰面积归一化法计算各物质的相对含量.

1.3.3 兴安杜鹃精油抑菌试验

利用NA培养基,采用斜面活化法对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)3种供试细菌菌株进行活化.将活化后的细菌菌株放入恒温培养箱培养,在细菌菌株的光密度值(OD)达到0.8时,用接种环取菌种放入液体培养基中,然后放在摇床上培养.在细菌菌株生长至对数生长期后制成细菌浓度约为1.0×108cfu/mL的供试菌液,放在避光且环境温度恒为4 ℃环境中备用.

1)抑菌效果测定.采用滤纸片法,通过测定抑菌圈直径判断兴安杜鹃精油的抑菌效果.用打孔器将滤纸制成直径6 mm的小圆形纸片,灭菌冷却后放入精油中浸泡12 h备用,以正己烷、无菌水作为空白对照,以青霉素溶液作为抑菌对照.在超净工作台中,取200 μL菌悬液均匀涂在固体培养基表面,制成菌平板;将精油、无菌水、正己烷及青霉素溶液浸泡过的滤纸片均匀放在菌平板表面,将制作好的平板放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h,取出滤纸片并采用十字交叉法测量抑菌圈直径,重复试验3次取平均值.

2)最小抑菌浓度(MIC)测定.设置10个精油浓度梯度,分别为50、20、10、5、1.25、0.062 5、0.015 6、0.007 8、0.003 9、0.000 2 μg/mL.在含1 mL精油的液体培养基中加入10 μL菌悬液后置于37 ℃培养箱中培养24 h,将菌悬液试管和对照管的菌液均匀地涂抹在营养平板上培养并计数,通过观察营养平板上菌落数确定最小抑菌浓度.

2 结果与分析

2.1 工艺优化

2.1.1 单因素试验结果

1)不同质量分数NaCl对精油提取率的影响.由图1可知:精油提取率随NaCl质量分数的逐渐变大呈先升高再降低趋势,当NaCl质量分数为4%时,精油提取率最高(0.52%).由方差分析可知,NaCl质量分数不同时精油提取率差异达到显著水平(P<0.05).兴安杜鹃精油提取率不同可能是由于氯化钠在水中电离后产生的Na+使其产生压力差,有利于精油较好地析出,也存在加入NaCl降低兴安杜鹃精油在水中溶解度的可能,有助于蒸馏;然而,当NaCl质量分数增大时,叶片中其他易溶成分析出更多,温度上升缓慢,不易沸腾,从而抑制了精油浸出.水蒸气蒸馏时加入适量NaCl,使得精油更加澄清,能够提高精油的品质[20].综上,加入适量NaCl可提高兴安杜鹃精油提取率,精油提取的最佳NaCl质量分数为4%.

图1 NaCl质量分数对兴安杜鹃精油提取率的影响

2)不同液料比对精油提取率的影响.由图2可知:精油提取率随着液料比的提高呈现先上升后下降趋势.当液料比为10 mL/g时,精油提取率最高(0.52%).由方差分析可知,不同液料比精油提取率差异达到显著水平(P<0.05).液料比较小,加热时原料未能被水分充分浸透,阻碍了精油析出,导致部分叶片受热不均,致使原料损毁,对精油质量产生负作用[19];当蒸馏水过量时,需加热许久才能达到沸点,耗能增加,导致精油提取率减少[21].分析可知:兴安杜鹃精油提取的最佳液料比为10 mL/g.

图2 液料比对兴安杜鹃精油提取率的影响

3)不同蒸馏时间对精油提取率的影响.由图3可知:兴安杜鹃精油提取率随蒸馏时间增加而逐渐升高,当蒸馏时间达到2 h时,精油提取率增长迅速,而后逐渐放缓,最后在5 h时趋于平稳,提取率为0.63%.由方差分析可知,不同蒸馏时间精油提取率差异达到显著水平(P<0.05).蒸馏时间越长,消耗能源越多.由于既要在得到较高提取率的同时,也要节约能源,因此,要选择合适的蒸馏时间.虽然兴安杜鹃精油提取率在蒸馏时间为5 h时最高,但为了节约能源,合理开发,在实际生产中建议蒸馏时间采用2 h.

图3 蒸馏时间对兴安杜鹃精油提取率的影响

4)不同提取部位对精油提取率的影响.由图4可知:不同部位精油提取率不同.兴安杜鹃叶片、1 a生枝、多年生枝的精油提取率分别为0.39%、0.08%和0.05%.由方差分析可知,不同提取部位兴安杜鹃精油提取率差异达到显著水平(P<0.05).由此可知,兴安杜鹃叶片精油产率最高.

图4 提取部位对兴安杜鹃精油提取率的影响

2.1.2 正交试验结果

在对兴安杜鹃精油提取率进行单因素试验分析的基础上设计正交试验,正交试验结果、方差分析分别见表2和表3.由表2可知:影响精油提取率的3个因素从大到小为B(蒸馏时间)>A(NaCl质量分数)>C(液料比),各因素的最优组合为A1B3C2,即NaCl质量分数为3%,蒸馏时间为3 h,液料比为10 mL/g,在此条件下的提取率为0.47%,并验证了3次.由表3可知,蒸馏时间、液料比和NaCl质量分数对兴安杜鹃精油提取率的影响均达显著水平.

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.1.3 响应面优化结果

在单因素试验的基础上,选取蒸馏时间、液料比及NaCl质量分数作为影响因素,以兴安杜鹃精油提取率为响应值,研究各影响因素及其交互作用对响应值的影响.用Design-Expert软件设计3因素3水平试验方案,共产生17组试验方案.响应面试验结果见表4.以兴安杜鹃精油预处理条件——蒸馏时间(A)、液料比(B)和NaCl质量分数(C)为自变量,以兴安杜鹃精油提取率为因变量y(%),建立二次多项式回归方程:y=0.41-0.031A+0.045B-0.001 3C-0.002 5AC-0.015BC+0.013A2-0.024B2-0.062C2,方程拟合相关系数R2高达0.997 6,P<0.01,失拟项不显著(P=0.449 5>0.05),表明模型拟合效果良好,可应用于兴安杜鹃精油提取工艺优化.方程相关变量分析结果见表5.

表4 响应面试验设计及结果

表5 试验因素方差分析

由表5可知:蒸馏时间对精油提取率有极显著影响,NaCl质量分数及液料比有显著影响,影响从大到小为B>A>C.从响应面三维图形和等高线投影可以显示出各因素对响应值的影响和交互作用大小.由图5～图7可见,等高线呈椭圆形且响应面曲线较陡,所以,3个因素交互作用对兴安杜鹃精油提取率均有显著影响.

图5 蒸馏时间与NaCl质量分数对兴安杜鹃精油提取率的影响

图6 液料比与NaCl质量分数对兴安杜鹃精油提取率的影响

图7 蒸馏时间与液料比对兴安杜鹃精油提取率的影响

2.1.4 兴安杜鹃精油最佳工艺条件验证

为进一步得到提取兴安杜鹃精油的最优工艺参数,根据二次多项式回归方程对最佳结果进行研究.通过响应面分析得出水蒸气蒸馏法提取兴安杜鹃精油最佳工艺为液料比9.89 mL/g、蒸馏时间2.96 h、NaCl质量分数为3%,在此条件下精油提取率为0.472 1%.通过3次重复试验得出精油提取率平均值为0.47%±0.05%,在最佳提取条件下的兴安杜鹃精油提取率与响应面优化的预测值十分接近,拟合状况良好,说明得出的兴安杜鹃精油提取工艺参数可靠并具有应用价值.

2.2 兴安杜鹃精油化学成分

兴安杜鹃精油离子流色谱见图8.对兴安杜鹃精油进行GC-MS检测,对照GC-MS谱图检索NIST图库,结合相关文献定性描述精油化学成分.通过GC-MS分析,由兴安杜鹃中共检测出47种有效成分,含量达到提取总量的97.41%.各成分及其相对含量见表6.由表6可知:兴安杜鹃精油主要由烯烃类、醇类、醛类及酚类等化学成分组成,1,4,7,-Cycloundecatriene,1,5,9,9-tetramethyl-,Z,Z,Z-为兴安杜鹃精油的主要成分,占精油总含量的39.82%,其中包含部分具有应用价值的物质,如松油醇,具有显著的平喘功效;乙酸龙脑酯,具有强心肺、强祛痰能力及缓解呼吸道不适等功效.

图8 兴安杜鹃精油气相色谱-质谱联用总离子流色谱

表6 兴安杜鹃精油化学成分及相对含量

2.3 兴安杜鹃精油抑菌性

2.3.1 兴安杜鹃精油抑菌活性

图9为兴安杜鹃精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈试验结果.由图9可见:兴安杜鹃精油对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌作用,金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到了14.97 mm和12.70 mm,根据抑菌圈判定标准,兴安杜鹃精油对其抑菌作用效果均表现为敏感,而对大肠杆菌无明显抑菌效果.试验表明:3个菌种中兴安杜鹃精油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,对枯草芽孢杆菌的抑制效果较好,对大肠杆菌的抑制效果不显著.

1.兴安杜鹃精油;2.1%青霉素;3.无菌生理盐水;4.正己烷.

2.3.2 兴安杜鹃精油的最低抑菌浓度(MIC)

表7为兴安杜鹃精油对3种细菌的最低抑菌浓度测定结果.由表7可知:兴安杜鹃精油具有显著的抑菌效果,对枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌的MIC分别为0.015 6、0.003 9 μg/mL.试验表明:3个菌种中,兴安杜鹃精油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强.

表7 兴安杜鹃精油对3种细菌的最小抑制浓度

3 结 论

1)水蒸气蒸馏法提取兴安杜鹃精油的最佳工艺.试验可知,NaCl质量分数、蒸馏时间及液料比对兴安杜鹃精油提取率均有显著影响,其中,蒸馏时间的影响最大.正交试验表明:提取精油的最佳组合为NaCl质量分数3%、蒸馏时间3 h、液料比10 mL/g,经验证,在最优组合下精油提取率为0.47%.响应面优化法显示的最佳组合为NaCl质量分数3%、蒸馏时间2.96 h、液料比9.89 mL/g,在此条件下精油提取率为0.472 1%,实际值为0.47%,二者拟合良好.

2)兴安杜鹃精油的化学成分.通过分析,共检测出47种化合物,占所提取精油总量的97.41%.精油主要由烯烃类、醇类、醛类及酚类等化合物组成,1,4,7,-Cycloundecatriene,1,5,9,9-tetramethyl-,Z,Z,Z-为精油的主要成分,占总含量的39.82%.

3)兴安杜鹃精油的抑菌性.精油对金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌作用,抑菌圈直径分别为14.97、12.70 mm,均表现为敏感,MIC分别为0.003 9、0.015 6 μg/mL.由此说明,兴安杜鹃精油对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好,对枯草芽孢杆菌的抑菌效果次之;精油中的γ-松油烯、石竹烯、β-月桂烯等为良好的抑菌化合物,具有良好的抑菌效果.