中华蜜蜂肠粘蛋白AcMucin5AC-1的鉴定和定位分析

李小青, 郭 悦, 张 洁, 周泽扬, 党晓群

(重庆师范大学, 农业农村部长江上游传粉昆虫资源保护与利用重点实验室(部省共建),重庆市媒介昆虫重点实验室, 重庆 401331)

蜜蜂是自然界重要的授粉昆虫之一,在维持生态系统平衡和作物授粉方面具有重要的经济价值和社会效应(吴杰等, 2014)。昆虫粘蛋白不仅构成了肠道粘液层也是围食膜的重要组成成分。昆虫粘蛋白按照其分泌方式及分布部位的不同,可分为与围食膜相关的分泌型粘蛋白以及与微绒毛膜相关的膜结合粘蛋白(Diasetal., 2018)。尽管不同物种粘蛋白分子量和蛋白质序列差异很大,但典型结构均为包含半胱氨酸的2型几丁质结合结构域(cysteine-containing type-2 chitin binding domain, ChtBD2)和粘蛋白结构域(mucin domain, MD),MD中富含脯氨酸(Pro)和含有糖基化位点的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)的组成的联重复序列,MD高度糖基化使围食膜获得很强的润滑性以及对水解酶的稳定性(Kramerovetal., 1996)。目前在昆虫中发现了大量粘蛋白和粘蛋白样蛋白,家蚕Bombyxmori(夏丹丹等, 2015)、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster(Syedetal., 2008)和白纹伊蚊Aedesalbopictus(Dengetal., 2020)等昆虫的粘蛋白主要分布在唾液腺、中肠、马氏管和围食膜,在参与调节宿主的生长发育和病原防控中发挥着重要的生理作用。果蝇粘蛋白基因Muc68E参与了代谢调节,影响食物吸收效率以及成年果蝇的体型,并对饥饿和寒冷有一定耐受性,推测这可能是粘蛋白的一种新的功能(Reisetal., 2016)。飞蝗Locustamigratoria粘蛋白基因Lmhemomucin和Lmmucin-12被RNAi后,发现飞蝗在若虫向成虫转变的蜕皮过程中35%～55%的若虫不能蜕皮并在蜕皮前死亡,表明其对蝗虫生存至关重要。干扰飞蝗粘蛋白LmIIM3后,在飞蝗胃、盲肠和中肠均表现出形态缺陷以及围食膜厚度比对照组更薄,表明LmIIM3参与形成围食膜(Zhaoetal., 2020)。

目前,有关粘蛋白在其他昆虫的发育、结构和功能方面的研究已有大量积累。然而,对于蜜蜂中有关于粘蛋白的研究鲜有报道。Huang等(2019)研究东方蜜蜂微孢子虫Nosemacerance时发现,饲喂靶向东方蜜蜂微孢子虫基因编码的Dicer(siRNA-Dicer组)的小干扰RNA阻断东方蜜蜂微孢子虫的RNA干扰机制,可使东方蜜蜂微孢子虫的量显著下调,而东方蜜蜂粘蛋白-2(Mucin-2)与未加Dicer小干扰RNA相比呈显著上调,表明东方蜜蜂微孢子虫量的减少可能是因为东方蜜蜂增强了自身围食膜粘液屏障。本课题组前期研究发现,中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染中华蜜蜂Apisceranacerana后,AcMucin5AC-1被下调。因此,本研究通过免疫定位和RNAi等技术对中华蜜蜂AcMucin5AC-1的生物学功能进行探究,为进一步深入解析AcMucin5AC-1蛋白在蜜蜂的生长发育中的重要功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与病毒

健康中华蜜蜂幼虫购自重庆市璧山区个体户蜂农养殖场;CSBV病毒粒子由重庆师范大学资源昆虫及其病原微生物学实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器

实验所用的Premix Taq、pMD19-T Vector、Solution Ⅰ连接酶、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ购于TaKaRa公司:EvoScript Universal cDNA Master反转录试剂盒、FastStart Essential DNA Green Master荧光定量PCR试剂盒购于Roche公司:扩增目的基因的引物、大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞、表达菌株Rosetta (DE3)感受态细胞、D-果糖、D-葡萄糖和酵母提取物(yeast extract)、琼脂粉(agar)、氯化钠(NaCl)、卡那抗生素(Kana)、十二烷基磺酸钠(SDS)等购于生工生物工程股份有限公司;RIPA裂解液、抗荧光淬灭剂等购于碧云天生物技术有限公司;氯仿、冰醋酸、甲醇和二甲苯等常用试剂购于重庆化学试剂有限公司。

荧光定量 PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司)、智能人工气候箱(上海谷宁仪器有限公司)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、蛋白质免疫印迹成像系统(上海培清科技有限公司)、体式解剖显微镜(莱卡显微系统(上海)有限公司)等。

1.3 Mucin5AC生物信息学分析

Mucin5AC基因序列和蛋白质序列下载于NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),中华蜜蜂AcMucin5AC的GenBank登录号分别为XM_028522949.1, XM_016907334.1, XM_016917484.1, XM_016908527.1, XM_016907334.1, XM_016913703.1, XM_016912343.1, XM_016911427.1和XM_016911428.1;西方蜜蜂A.melliferaMucin5AC的GenBank登录号分别为XM_006562291.2, XM_016770836.2, XM_ 026297546.1, XM_026302220.1, XM_026296595.1, XM_006569552.2, XM_006570794.1和XM_ 026295456.1。通过NetPhos 3.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetNGlyc 1.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetOGlyc 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)预测磷酸化和糖基化位点;通过TMHMM v2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)对跨膜结构域、信号肽以及结构域进行预测;通过MotifScan(https:∥www.genome.jp/tools/motif/)和WegoLoc(http:∥www.btool.org/WegoLoc)功能基序分析和亚细胞定位等在线分析软件分别对中华蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC的蛋白质序列特征进行比较分析。

1.4 AcMucin5AC-1表达量分析

首先,使用无菌移虫针从中华蜜蜂巢脾的巢穴中取2日龄幼虫放至24孔板中,盖好盖子后放入人工气候培养箱中(温度为35 ℃,湿度为85%);培养24 h后,观察幼虫的存活情况;挑选出死亡及没有活力幼虫,其余2日龄幼虫一部分用于收集4日龄时的中肠和表皮,每种组织来自3头个体作为1个生物学重复;另一部分用于CSBV接种,分为两组,一组为饲喂不含CSBV食物的对照组,另一组饲喂含CSBV食物(107copies/头),随后两组均添加正常食物培养;在添食CSBV病毒后的0, 12, 24, 48和72 h时各取6头中华蜜蜂幼虫的中肠,经灭菌ddH2O、75%乙醇和DEPC水清洗后,冻存于-80 ℃备用。其次,采用Trizol 法提取总RNA,参照EvoScript Univerrsal cDNA Master试剂盒说明合成cDNA。最后,以中华蜜蜂AcActif基因为内参基因,并通过qRT-PCR检测AcMucin5AC-1在4日龄幼虫中肠和表皮中以及2日龄幼虫接种CSBV后中肠中的表达量,用CSBV的结构蛋白VP1基因的相对表达量检测幼虫体内CSBV的情况,引物序列见表1。使用CFX96TMTouch实时定量PCR系统进行qRT-PCR,反应体系: ddH2O 7 μL, Green Master 2×conc. 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 1 μL。反应程序: 95 ℃预变性10 min; 95 ℃变性10 s, 56/50 ℃退火10 s, 72 ℃延伸20 s, 熔解曲线65～95 ℃, 增幅0.5 ℃ 5 s, 39个循环。每个样品进行3次技术重复以及3次生物学重复。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 AcMucin5AC-1的原核表达和多克隆抗体制备

根据GenBank中AcMucin5AC-1(GenBank登录号: XM_028667148.1)序列设计特异性引物(表1),以1.4节合成的中华蜜蜂cDNA为模板进行体外扩增。PCR反应体系: cDNA 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL, Ex Taq Master Mix 5 μL,ddH2O 6 μL。PCR反应程序: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性40 s, 61.8 ℃退火40 s, 72 ℃延伸1 min, 32个循环;72 ℃终延伸1 min, 12 ℃保存。通过1%琼琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段,与pMD19-T载体连接后,将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经筛选阳性克隆并提取质粒,重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸测序。测序后的阳性的重组质粒pMD19-AcMucin5AC-1亚克隆至pET-28a载体,构建pET28a-AcMucin5AC-1转入大肠杆菌RosettaTM(DE3)感受态细胞中培养。挑取阳性单克隆菌进行IPTG诱导表达。利用亲和层析柱纯化重组蛋白,操作步骤根据Ni-NAT Superflow Cartridge蛋白纯化柱的说明书进行,将纯化的AcMucin5AC-1重组蛋白作为抗原免疫云南昆明雌性小鼠,制备多克隆抗体。

1.6 AcMucin5AC-1在中华蜜蜂幼虫中的表达及定位分析

采用RIPA裂解法提取中华蜜蜂3-6日龄幼虫中以及4日龄幼虫中肠、表皮和围食膜的总蛋白,利用1.5节制备的多克隆抗体anti-AcMucin5AC-1-M作为一抗,HRP标记的羊抗鼠为二抗进行免疫印迹检测,分析AcMucin5AC-1在上述不同发育阶段和4日龄幼虫组织中的表达。取新鲜中华蜜蜂4日龄幼虫, 4 ℃避光固定于Gluta固定液中,通过包埋剂OTC(optimal cutting temperature compound)包埋幼虫后,再将包埋的样品切成厚度5 μm的横切片,用粘附型破片捞出切片后置于4 ℃保存备用。通过间接免疫荧光技术,将多克隆抗血清anti-AcMucin5AC-1-M为一抗,Alexa Fluor 488(488-N-羟基琥珀酰亚胺酯)亮绿色荧光染料标记的羊抗鼠为二抗,DAPI(4′,6-二脒基-2苯基吲哚)蓝色荧光的DNA染料,进行观察分析AcMucin5AC-1在4日龄幼虫中的定位。

1.7 AcMucin5AC-1的RNAi和效果检测

以pMD19-T-EGFP质粒和pMD19-T-AcMucin5AC-1质粒分别作为EGFP和AcMucin5AC-1的dsRNA体外扩增的模板,使用含有T7启动子的特异性引物(表1),利用Promega公司的T7 RiboMAXTMExpress RNAi System合成dsRNAs。参考1.4节幼虫培养方法收集2日龄幼虫设置两个干涉组,一组添加dsEGFP作为对照组,另一组添加dsAcMucin5AC-1作为实验组,dsRNA用量为2.0, 1.0和0.5 μg/头,饲喂12, 24, 48和72 h时每处理各取6头活幼虫,提取中肠RNA并合成cDNA,将cDNA定量到100 ng/μL进行qRT-PCR,方法同1.4节,每处理生物学重复3次。取最佳干扰条件下的整头幼虫制备石蜡切片,通过HE染色后观察RNAi干扰AcMucin5AC-1后24, 48和72 h时幼虫形态。

1.8 数据分析

利用Bio-Rad CFX Manager软件内置程序2-ΔΔCt方法进行计算(Livak and Schmittgen, 2001) RT-qPCR检测的基因表达量,利用GraphPad Prism进行数据统计分析和作图,使用t检验进行干扰效率和差异显著性分析。

2 结果

2.1 中华蜜蜂和西方蜜蜂的Mucin5AC基因序列

结合在其他物种中已经报道Mucin特征,对中华蜜蜂和西方蜜蜂的基因组进行检索和比对,发现中华蜜蜂基因组和西方蜜蜂基因组中都有8个Mucin5AC基因。通过生物信息学分析对中华蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC粘蛋白结构域内的PTS/TS残基比例和串联重复序列百分比、O-糖基化百分比、信号肽、结构域进行了比较分析。结果表明,中华蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)占Mucin5AC全长的21%～50%,而西方蜜蜂的为27%～40%。中华蜜蜂中有6个Mucin5AC(Ac016908527.1, Ac016907334.1, Ac016913703.1, Ac016912343.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1),氨基酸序列中S+T/P+T+S含量占整个蛋白的20%以上,为粘蛋白Mucin5AC,另外3个Mucin5AC(Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016917484.1)氨基酸序列中S+T/P+T+S重复区含量低于20%,为类粘蛋白(Mucin5AC-like)。西方蜜蜂中的8个Mucin5AC蛋白,S+T含量均大于20%,即为粘蛋白。中华蜜蜂Mucin5AC的O-糖基化(O-Glyc)占13%～39%,西方蜜蜂的占14%～19%。中华蜜蜂Mucin5AC包含的半胱氨酸数目在10～51个之间,西方蜜蜂的在4～27个之间。中华蜜蜂Mucin5AC特有的重复序列中T含量较多,西方蜜蜂中S含量较多,暗示中华蜜蜂Mucin5AC的糖基化(O-Glyc)位点多发生在S,而西方蜜蜂的多发生在T。

利用SMART预测保守结构域,发现中华蜜蜂中Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac16912343.1具有信号肽,表明这些是分泌性粘蛋白。Ac028522949.1, Ac016907334.1和Ac016907334.1具有2型的几丁质结合结构域ChtBD2和PTS重复序列,这些ChtBD2内均含有保守6个半胱氨酸,属于围食膜因子(Peritrophin-A),预示这几个蛋白可能定位于昆虫肠道围食膜。Ac016913703.1, Ac016911427.1和Ac016911428.1含有类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)活性位点Tryp_SPc结构域。Ac016907334.1含有糖苷水解酶18(O-glycosyl hydrolases18)家族的Glyo18结构域。与中华蜜蜂Mucin5AC相比,西方蜜蜂Mucin5AC氨基酸序列中均不含有ChtBD2和Glyo18结构域; Am006562291.2和Am016770836.2中含有锚蛋白重复基序(ankyrin repeat, ANK),Am026297546.1和Am006569552.2含有“溴”蛋白结构域(bromo domains, BROMO),可结合乙酰化赖氨酸残基存并在相互作用; Am026302220.1具有4个CysCysHisHisCys(CCHHC)形成的环型锌指结构域(zinc finger domains, Znf); Am026295456.1中含有1个“螺旋-环-螺旋”结构域(helix loop helix domain, HLH domain)(图1)。

2.2 CSBV病毒侵染后中华蜜蜂幼虫中AcMucin5AC-1的表达量

AcMucin5AC-1 在4日龄幼虫的中肠和表皮均有表达,但在中肠中的表达量比在表皮中的表达量显著高72%(P<0.05),表明AcMucin5AC-1在中肠组织大量表达(图2: A)。CSBV病毒侵染后与未感染CSBV病毒的对照组比较,VP1基因在感染CSBV病毒的幼虫中持续上调,在感染的48 h时幼虫中达到最高相对表达量,说明CSBV病毒已侵染中华蜜蜂幼虫,并在体内持续增殖(图2: B);AcMucin5AC-1在感染CSBV病毒的幼虫中肠中表达呈现整体下调,且在感染12和72 h时的幼虫中表达量显著降低(P<0.05)(图2: C),表明CSBV病毒的侵染对AcMucin5AC-1在中肠组织的表达量产生了影响。

图2 中华蜜蜂4日龄幼虫中肠和表皮中AcMucin5AC-1的表达量(A)以及CSBV侵染2日龄幼虫不同时间中肠中VP1(B)和AcMucin5AC-1的表达量(C)Fig. 2 Expression levels of AcMucin5AC-1 (A) in the midgut and cuticle of the 4-day-old larva of Apis cerana cerana,and of VP1 (B) and AcMucin5AC-1 (C) in the midgut of the CSBV-infected 2-day-old larva for different timeCK: 未感染CSBV的对照组 Control group without CSBV infection; CSBV: 中华蜜蜂囊状幼虫病毒Chinese sacbrood virus; VP1: CSBV的基因A gene of CSBV; CSBV: 感染CSBV组(107 copies/头) CSBV-infected group (107 copies/ind.). 图中据为平均值±标准误;柱上星号表示两组间差异显著(*P<0.05; ** P<0.01)(t检验)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

2.3 AcMucin5AC-1的原核表达及多克隆抗体

SDS-PAGE 电泳检测发现,重组蛋白主要以包涵体的形式表达(图3: A)。随后对重组蛋白 AcMucin5AC-1进行大量诱导表达并纯化(图3: B)将纯化后的重组蛋白作为抗原免疫昆明雌性小鼠以制备相应的多克隆抗体。免疫印迹分析发现,在50 kD左右处检测到单一的杂交信号条带(图3: C),说明重组蛋白AcMucin5AC-1的多克隆抗体制备成功。

图3 重组蛋白AcMucin5AC-1的表达(A)和纯化(B)的SDS-PAGE及多克隆抗体的Western blot检测(C)Fig. 3 SDS-PAGE of expression (A) and purification (B) of the recombinant AcMucin5AC-1 and Western blotting of polyclonal antibody (C)M: 蛋白分子量标准Protein molecular weight marker; 1: 未经IPTG诱导的pET28a pET28a uninduced by IPTG; 2: 经IPTG诱导的pET28a pET28a induced by IPTG; 3: pET28a-AcMucin5AC-1未经IPTG诱导pET28a-AcMucin5AC-1 uninduced by IPTG; 4: pET28a-AcMucin5AC-1经IPTG诱导pET28a-AcMucin5AC-1 induced by IPTG; 5: pET28a-AcMucin5AC-1诱导表达产物上清 Induced product supernatant of pET28a-AcMucin5AC-1; 6: pET28a-AcMucin5AC-1诱导表达产物沉淀Induced product precipitation of pET28a-AcMucin5AC-1; 7: 纯化的重组蛋白AcMucin5AC-1 Purified recombinant AcMucin5AC-1; 8: 重组蛋白AcMucin5AC-1与多克隆抗体杂交Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with polyclonal antibody; 9: 重组蛋白 AcMucin5AC-1与阴性血清杂交 Recombinant AcMucin5AC-1 hybridized with negative serum.

2.4 AcMucin5AC-1蛋白的表达和定位

在中华蜜蜂3-6日龄幼虫总蛋白均能在80 kD之间杂交到信号条带(图4: A),与实际预测分子量(252.18 kD)不一致,推测可能的原因是AcMucin5AC-1分子量较大,在抽提蛋白时可能会引起蛋白降解,所以杂交到80 kD的降解条带。同时,AcMucin5AC-1的抗体在4日龄幼虫各组织总蛋白中也能杂交到相同大小的单一条带(图4: B),表明其在中华蜜蜂幼虫的中肠、表皮和围食膜均有表达。

利用间接免疫荧光技术通过荧光显微镜进行观察,蓝色荧光表示细胞核,绿色荧光表示AcMucin5AC-1蛋白分布情况,在4日龄幼虫中,AcMucin5AC-1分布在中肠、围食膜、肠腔基底膜周围(basement membrane, BM)和微绒毛(microvilli, Mi)(图5)。因此,推测AcMucin5AC-1可能是参与围食膜形成。

图5 间接免疫荧光检测AcMucin5AC-1在中华蜜蜂幼4日龄虫中的定位Fig. 5 Indirect immunofluorescence detection of the localization of AcMucin5AC-1 in the 4-day-old larva of Apis cerana ceranaNegative: 阴性血清(对照组)Negative serum (control group); UV: 紫外线Ultraviolet ray; DAPI: DAPI标记的细胞核 DAPI-labeled nuclei; Alexa Fluor 488: Alexa Fluor 488标记的AcMucin5AC-1 Alexa Fluor 488-labeled AcMucin5AC-1; Merge: DAPI和Alexa Fluor 488的叠加 Superposition of DAPI and Alexa Fluor 488; PM: 围食膜Peritrophic membrane; Mi: 微绒毛Microvilli; BM: 肠腔基底膜Basement membrane of the intestinal lumen; MG: 中肠Midgut.

2.5 AcMucin5AC-1的RNAi

qRT-PCR检测结果表明,2.0 μg/头dsRNA处理中华蜜蜂2日龄幼虫后24 h时AcMucin5AC-1在中肠中的表达量比对照组(dsEGFP)显著下调92% (P<0.01)(图6)。

图6 中华蜜蜂2日龄幼虫饲喂dsAcMucin5AC-1后AcMucin5AC-1在中肠中的表达量Fig.6 Expression levels of AcMucin5AC-1 in the midgut after feeding the 2-day-old larva of Apis cerana larvae with dsAcMucin5AC-1图中数据为平均值±标准误;柱上星号表示两组间差异显著(*P<0.05; ** P<0.01)(t检验)。Data in the figure are mean±SE. The asterisk above bars indicates significant difference between the two groups (*P<0.05; ** P<0.01)(t-test).

RNAi处理24, 48和72 h时各组织结构形态较为完整,围食膜、柱状细胞(columnar cell, CC)的微绒毛、柱状细胞、脂肪体的滋养细胞(trophocyte, Tr)和绛色细胞(oenocyte, Oe)均清晰可见。AcMucin5AC-1被RNAi后24 h时(图7: D)和48 h时(图7: J)的幼虫组织与对照组相比没有明显差异,均呈现出细胞核小而圆,细胞之间的间隙较小;但RNAi后72 h时的幼虫 (图7: P)细胞间隙增大,细胞和细胞核的形状变得细胞间界限不清晰,细胞排列散乱。

3 讨论与结论

昆虫在漫长的进化过程中,已经形成了独特的肠道防御机制,包括物理防御和免疫反应(Zengetal., 2022)。围食物膜是昆虫肠道物理防御系统的重要结构,主要由几丁质和蛋白质组成(Hegedusetal., 2009; Kuraishietal., 2011)。而糖基化蛋白组成的黏液是另一个关键的物理结构(Miguel-Aliagaetal., 2018)。因此,解析昆虫粘蛋白特征对病原入侵宿主的机制研究具有十分重要的意义。

粘蛋白是一个大型、复杂的糖基化蛋白家族,其重要的特征是“粘蛋白结构域”。本研究中发现,虽然中西方蜜蜂Mucin5AC蛋白均含有粘蛋白样结构域(MD),但中华蜜蜂Mucin5AC粘蛋白结构域中ST/PTS串联重复序列、O-糖基化位点和半胱氨酸数目都高于西方蜜蜂。其中,中华蜜蜂AcMucin5AC-1(028522949.1)含有ChtBD2和MD。根据含有CBD结构域的典型特征,将围食膜因子分为peritrophin-A, peritrophin-B和peritrophin-C 3类(Tellametal., 1999),中华蜜蜂AcMucin5AC-1的ChtBD2结构域中含有6个半胱氨酸,其保守基序为X2-5CX10-11CX5-6CX12-15CX12-13CX8-10CX8-9,推测该蛋白属于围食膜peritrophin-A,表明AcMucin5AC-1可能参与围食膜形成,ChtBD2结构域中保守的半胱氨酸残基形成蛋白内部的二硫键结构,以提高蛋白质在富含消化水解酶的中肠环境中能够保持稳定性(Kuraishietal., 2011)。MD结构域中串联重复序列的糖基化位点可能充当了病原物的吸附位点从而阻止病原物同上皮细胞结合(李新娜, 2012),暗示粘蛋白可能是昆虫病原防控的潜在靶标。同时,对中华蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC结构域比较分析发现,中华蜜蜂Mucin5AC含特异ChtBD2结构域、Glyo18结构域和Tryp_SPc结构域(图1)。西方蜜蜂Mucin5AC有特异的BROMO结构域、ANK结构域、HLH 结构域、Znf-结构域。中华蜜蜂和西方蜜蜂Mucin5AC结构域的差异暗示该蛋白家族在中华蜜蜂和西方蜜蜂中的功能发生了分化,为今后研究Mucin5AC在中华蜜蜂和西方蜜蜂中的生物学功能奠定了基础。

本研究获得了AcMucin5AC-1的外源重组蛋白,主要以包涵体形式表达(图3: A)。Western blot显示该蛋白分子量的实际大小为50 kD(图3: C),比预测的分子量(35 kD)偏大,经过核酸测序比对没有发现突变现象;推测可能因为AcMucin5AC-1蛋白的ChtBD2结构域富含半胱氨酸,导致重组蛋白AcMucin5AC-1形成分子间或分子内二硫键,导致免疫印迹结果中的蛋白分子量偏大。利用获得的多克隆抗体anti-AcMucin5AC-1对中华蜜蜂3-6日龄幼虫(图4: A)和4日龄不同组织AcMucin5AC-1的蛋白水平进行检测,在中肠、表皮和围食膜都检测到信号条带(图4: B)。间接免疫荧光实验表明AcMucin5AC-1蛋白主要分布在中肠和围食膜(图5)。Hegedus等(2009)根据昆虫围食膜的合成部位差异,将围食膜分为由中肠上皮细胞分泌到肠腔形成的I型围食膜和由前肠和中肠交界处贲门细胞分泌的II型围食膜,推测AcMucin5AC-1可能是由中肠合成之后分泌至肠腔参与围食膜的构成,这与同为膜翅目的无刺蜜蜂所报道的结果(Marques-Silvaetal., 2005; das Dores Teixeiraetal., 2015)一致。

本研究确定了dsAcMucin5AC-1在幼虫组织的干扰条件,即dsRNA的量为2.0 μg/头,干扰时间为24 h时能最大程度沉默AcMucin5AC-1(图6)。通过HE染色观察干扰AcMucin5AC-1后的72 h时的中华蜜蜂幼虫切片(图7),发现细胞间隙增大,细胞和细胞核的形状变得不规则,推测沉默了AcMucin5AC-1可能会影响细胞间的松散程度。对照组dsEGFP干扰的48 h时能观察到由微绒毛分泌蛋白以形成围食膜,而dsAcMucin5AC-1处理48 h时则没有观察到,AcMucin5AC-1的沉默减少了AcMucin5AC-1的蛋白合成,由于AcMucin5AC-1蛋白的减少使得围食膜的形成受阻。因此,后续的研究将重点关注AcMucin5AC-1在围食膜形成中的作用,为解析围食膜在CSBV病毒感染过程中的作用奠定基础。